高中生物二轮大-PCR 公开课

《二轮大专题—PCR专题》

【命题角度1]PCR的基础知识

1.PCR的基本要点（表解）：

名称及缩写(1)▲、▲

目的(2)▲

原理(3)▲

前提(4)▲

(5)▲▲

(6)▲▲

反应体系(7)▲▲

(8)▲▲

(9)▲、▲

(10)▲▲

反应过程(11)▲▲

(12)▲▲

(13)▲长一中链：（14）▲

反应结果中TO：（⑸▲

短~~^链：（16）▲

反应设备(17)▲

PCR的操作要点(18)▲

2.PCR中图解（3次循环）：

殳性停

3

3.PCR过程中使用的酶具备三个特点:

①(19)_▲

②(20)_▲

③(21)_▲

4.PCR中的引物:

来源(22)_▲

作用及要求(23)_▲

类型(24)_▲

朝向(25)_▲

变化(26)_▲

［例1］近十年来，PCR技术（多聚酶链式反应）成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用

DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍

甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。回答下列问题：

18*枚

juMSwT阵备至SST

DNA样品单链DNA两个完整的双

引物与DNA游离脱辄核甘酸连

模板单链形成配蕤到DNA单链上链DNA什

对结构

（1）加热94℃目的是打开▲键，这一步称为变性。

（2）当温度降低时，引物与模板▲端结合,在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终

合成两个DNA分子，此过程中原料是▲。

（3）PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环

境、适宜的▲和▲,前者由PCR仪自动调控，后者则靠▲来维持。

（4）DNA的复制需要引物，其主要原因是▲。退火温度的设置跟引物有关，若▲,退高温度

可以高点；若退火温度太低，会造成▲,不但会造成非目标DNA片段多，而且会出现无

序扩增。

（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有上（填序号：①升高退火

温度②降低退火温度③重新设计引物）。

［例2］1985年，穆利斯等人发明了PCR技术（即聚合酶链式反应）。它是一项根据DNA双链复制的原理，

在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核甘酸序列进行大量复制的技术。

回答下列问题：

（1）PCR反应体系的缓冲液一般需要添加」以激活酶。设定的PCR反应程序为：94℃,5min；

94℃,30s；55℃,30s；72℃,Imin；30个循环。其中，设定94℃下5min的预变性处理，

目的是确保▲。

（2）PCR扩增的产物常采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在▲下

被检测出来。若电泳结果不止一条带，可能的原因有▲（答出1条）。

（3）PCR技术可用于基因工程四个步骤中的▲以及目的基因的检测、鉴定。

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【命题角度2］反转录PCR(RTPCR)

起点是单链RNA,想以之为模板，通过PCR扩增得到大量的相应的、特定的DNA片段，而PCR

新的挑战

使用的热稳定的DNA聚合酶只能以DNA为模板

固有条件PCR扩增仪、热稳定的DNA聚合酶、足量的dNTP、缓冲体系、M/+等阳离子

解决策略▲

［例1］以下是有关冠状病毒的相关信息，请思考并回答:

(1)引起人类肺炎的某冠状病毒(nCoV)是一市单链RNA病毒，其跨膜表面糖蛋白(GP)是该

病毒侵染宿主细胞的关键蛋白，科学家欲利目大肠杆菌作为受体菌批量生产GP以制备相关

疫苗，研发疫苗要在短时间内大量快速生产采针可利用▲技术实现。从nCoV基因组中分

离出的nCoV—GP基因不能直接与质粒重组,其原因是▲。

(2)为了使nCoVTJP基因和质粒构建----------------------------新电病毒的RNA

基因表达载体，必须经过▲形成----------------------------新冠病毒的RNA

上再进行扩增两个过程，示意图C5----------------------------DNA.

如下。图示过程中需要的酶有▲,<=)----------------------------DNA.

-------------------tZJ--------DNA

需要添加的原料为▲,如果图中2

a---------------------------DNA.

共有N个箭头(N>2),以DM1

----------------□-------DNA2

这条链为模板开始扩增，共消耗CZJDNA.

；；

引物“I―I”▲个，共产生由CD-------------------DNA

DNA,和DNAs两条链组成的DNA分子

▲个。

(3)若第(2)问中实验操作没有失误，PCR反4任何扩增产物，则可以采取的改进

措施有▲(填序号：①升高退火温度，C.度，③重新设计引物)，请说明选

择以上改进措施的原因▲。

［例2］我国公布的禁止进境检疫的有害生物烟草环斑病毒(TRSV)是RNA病毒。检疫部门取烟草叶片进

行该病毒的诊断和检测，将待测样品利用RTPCR技术(逆转录PCR,具有灵敏度高、特异性强的

优势)扩增样品。下图1是RTPCR技术的过程示意图，图2是PCR扩增产物的电泳图。请回答下

列问题:

一、待测样品总RNA

图2PCR扩增产物电泳图

(1)图1过程①表示利用RNA获得cDNA,该过程需要▲酶的参与,过程②需要加入▲酶。

(2)待测样品中RNA的提供者可能是▲和▲,也可能只是▲。

(3)图1过程①需要加入引物P2,该引物是依据上的序列设计并生产的。过程②引物P2、P1

都需加入，理由是▲。

(4)已知图2中电泳带1是取自未感染的烟叶样品电泳结果，电泳带2是不同大小DNA的标准

参照，据图分析可以得出的结论是上，理由是▲。

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【命题角度3］反向PCR（IPCR）

要通过PCR扩增的不是已知序列的DNA片段，而是已知序列两侧的DNA片段，同向引物达不

新的挑战

到扩增的目的

固有条件PCR扩增仪、热稳定的DNA聚合酶、足量的dNTP、缓冲体系、蛇2+等阳离子

解决策略▲

［例1］（2020年江苏）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧

的序列，具体流程如图（以EcoRI酶切为例）。请据图回答问题：

染色体DNA

G：AATTC^I

I的切EcoRICTTAAiGJ

混合的DNA片段

、r未知序列己如序夕!r~[3'

未知序列b片段F

n连接|DNA连接酶

已知序列

PCR引物环状DNA

用扩增|hgDNA聚合•他

PCR产物

1\测序、分析|

y片段F的

完整序列

(1)步骤I用的EcoRI是一种▲酶,它通过识别特定的上切割特定位点。

(2)步骤H用的DNA连接酶催化相邻核昔酸之间的3,一羟基与5—一磷酸间形成▲；PCR循

环中，升温到95℃是为了获得▲；TaqDNA聚合酶的作用是催化▲。

(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤III选用的PCR引物必须是一上

（从引物①©③④中选择，填编号）。

DNA序列（出线处省略了部分核作腋序列）

已知5-AACFAKKGCTCAFGA........GCAATGC'G[AGCCTCJ—J*

惮列yiicjAiAciAuACitAiT........6GHA<XK\4Ms'

1)5-AACIATCX(X/TCAT(；A—3r

KR②5JAT(X；TA(；m—3'

引物.)5—；\C；A(»(iCTAC(；CATTGC-3'

①5'TCATGAGC(jCATAGTT-3’

（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略

了部分核昔酸序列），结果正确的是：▲。

A.5'—AACTATGCG..AGCCCTT—3,B.5'—AATTCCATG....CTGAATT—3Z

C.5'—GCAATGCGT..TCGGGAA—3'D.5'—TTGATACGC....CGAGTAC—3'

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【命题角度4】重叠延伸PCR

有2种已知(部分)序列的DNA片段，期望不再依靠限制酶切、DNA连接酶连的方式，而是

新的挑战

在通过PCR扩增2种DNA片段的过程中，能直接将二者连接起来，形成重组DNA片段

固有条件PCR扩增仪、热稳定的DNA聚合酶、足量的dNTP、缓冲体系、Mg"等阳离子

解决策略

［例1］重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核甘酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR

扩增，从而获得目的基因的方法。下图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。结合所

学知识，分析下列问题：

引物1引物3

目的基因

第一勰面

一引物21油4

-引物I

阶引物2引物3

段引物1

；；；；引物4

第

二引物2…，______引物4

阶之%3|

段引物1

引物

第——r*-r........4

三

阶

---目的基因

段

(1)在引物1、引物2组成的反应系统中，经第一阶段形成图示双链DNA至少要经过上次循环。

(2)若在引物1和引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均复制一次，共产

生▲种双链DNA分子。

(3)第二阶段中引物2与引物3部分碱基的▲关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。

(4)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，必须将引物1、2和引物3、4置于不同

反应系统中，这是因为▲。

(5)第三阶段进行重叠延伸时，是否需要额外添加引物▲,原因是▲。

【命题角度5］利用PCR在目的基因两侧添加适宜的限制酶识别序列

通过PCR扩增得到的目的DNA片段两侧没有限制酶识别序列，不便于用限制酶进一步处理；

新的挑战希望在PCR扩增目的DNA片段时直接在两侧添加期望的限制酶识别序列，便于进一步用相应

的限制酶切割，产生期望的黏性末端

固有条件PCR扩增仪、热稳定的DNA聚合酶、足量的dNTP、缓冲体系、Mg"等阳离子

解决策略▲

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【命题角度6］利用PCR对目的基因进行定点诱变

PCR扩增目的DNA片段时，不再完全忠实于模板DNA,而是能够对某一位点的碱基对进行替

新的挑战

换/增添/删除，使目的DNA片段发生定点突变

固有条件PCR扩增仪、热稳定的DNA聚合酶、足量的dNTP、缓冲体系、蛇2+等阳离子

解决策略▲

【例1］通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因

的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板

链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5,端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识

别位点。有关叙述不正确的是：

MaT

引物］__________________

"G二•引物2

第I轮PCR瑜

TT|/①

引物1•L-I---------------------------/

-丁------------Q引物2

(第2轮PCR第b

引削斗二二;二二二二中黑

人।酹h

t

A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入

B.复性温度过高会导致引物不能与模板牢固结合，PCR扩增效率下降

C.第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因

D.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2

【例2］大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核甘酸的定点诱变仅需进行

两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，

过程如图所示。下列叙述不正确的是：

诱变引物

第一轮PCR,,一

PCR产物而作大引物

­»»

第二轮PCR|

A.第一轮PCR过程中退火所用的温度与第二轮PCR退火的温度不一样

B.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，该定点诱变产物

需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译

C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链

D.将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),属于蛋白质工程

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［例3］萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达蛋

白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，做了相关研究。请回答下列问题：

(1)研究者将重组质粒置于经上处理的大肠杆菌细胞悬液中，获得转基因大肠杆菌。

(2)检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密

码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物(引物B和C中都替换了

一个碱基)，并按图中方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛋白A基因。

引物B引物D

y3-A-S了—%

¥:蛋白A基因—_

5'=^<-V—；、

引物A引物C

图1

s-----------------------------------r

IPCR3

y八---------y

、-------v------------------$

新的蛋白A基因

注।图中7V为碱基序列变化点，

①这是一种定点的▲技术。

②图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格(若选用该

引物划“，若不选用该引物则划“X”)▲。

引物A引物B引物c引物D

PCRi▲▲▲▲

▲▲▲▲

PCR2

▲▲▲▲

PCR3

▲▲▲▲

PCR4

(3)研究者进一步将含有新蛋白A基因的重组质粒和▲分别导入大肠杆菌,提取培养液中的

蛋白质，用▲方法检测并比较三组受体菌蛋白A的表达产物，判断新蛋白A基因表达效

率是否提高。为检测表达产物的生物活性，研究者将上述各组表达产物加入到长满了植物

病菌的培养基上，培养一段时间后，比较▲的大小,以确定表达产物的生物活性大小。

(4)作为微生物农药，使用时常喷洒蛋白A基因的发酵产物而不是转蛋白A基因的大肠杆菌，

其优点是▲。

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【命题角度7】巢式PCR

目的DNA片段在全部DNA中所占的比例太低，通过PCR对其扩增时，当引物特异性过强或过

新的挑战弱时，都很难扩增出足量的目的DNA片段，期望通过PCR能够精准又大量的扩增出目的DNA

片段

固有条件PCR扩增仪、热稳定的DNA聚合酶、足量的dNTP、缓冲体系、Mg2+等阳离子

解决策略▲

【例1］家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。巢式PCR扩增反应在两次PCR反应中使

用两组不同引物，先使用外引物对目标区域DNA片段进行第一次PCR扩增，产生中间产物，然后

使用内引物对中间产物进行第二次PCR扩增，产生目标产物。下图是式PCR工作原理示意图，请

回答：

模板2、、、、、、、、=X、、、g、、、­、、、、za、aa、、、zz、=

,」|使用外引物城祗？欠PCR扩增

中间产物

［使用内引♦进行第二次PCR扩增

目标产物,,

'巢式PCRI作原理示意图’

(1)巢式PCR反应体系中需要加入模板、上、上、引物、Mg"、缓冲液等。

(2)相比于常规PCR获得的产物而言，巢式PCR获得的产物特异性，，原因是如果利用外引

物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率上。

(3)巢式PCR通常在一个试管中进行第一阶段反应，然后将中间产物等转移到第二试管中进行

第二阶段反应，不在同一试管完成的主要原因是▲。

(4)科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的

酪蛋白基因(CSN1S1),进行早期胚胎的性别鉴定，并将鉴定后的胚胎进行移植。下表是

主要实验步骤，请完成下表：

实验目的方法步骤要点

胚胎样品DNA提取选取囊胚的①▲细胞提取DNA

PCR引物的设计和合成根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成②▲对引物

PCR过程预变性f③▲退火f延伸

观察扩增结果电泳分析

受体牛④▲处理对受体牛注射前列腺素

胚胎移植将筛选出的胚胎移植到受体牛的子宫内

(5)电泳结果如下图所示，1〜5号为取自不同胚胎的DNA样品进行巢式PCR的产物。A和B条

带中代表CSN1S1的是▲。可以确定1〜5号中▲号胚胎为雌性。

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A*

B*八一，

(6)牛胚胎性别的鉴定除了可以利用PCR外，下列方法也可行的有▲。

①差速离心法②核酸探针杂交法

③染色体核型分析法④H-Y抗血清免疫学法(H-Y抗原编码基因位于Y染色体上)

【命题角度8］不对称PCR

新的挑战通过PCR较快的得到单链DNA

固有条件PCR扩增仪、热稳定的DNA聚合酶、足量的dNTP、缓冲体系、姐2+等阳离子

解决策略▲

［例1］PCR技术应用非常广泛，可用于扩增目的基因，制作探针，引入定点突变，定量检测DNA等。

完成下列有关PCR技术和相关应用的问题：

(1)PCR技术可用于基因工程四个基本步骤中的▲步骤。

(2)在影响扩增反应的各种因素中，引物的设计最为重要，引物的3,端应采用简并密码较少的

氨基酸的对应核甘酸序列，否则会导致扩增的非特异性序列数量上。

(3)在正常变性和退火之后研究某TaqDNA聚合酶的催化效率，得到了下列表格:

22℃37℃55℃70℃78℃83℃

子链延伸速率(个核甘酸.秒\酶分子为0.251.522602500

83℃下没有产物的原因是上。

(4)PCR反应后期，由于▲等原因,反应速率会降低。

(5)PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会因为▲,最终都会导致反应效率降

低。退火温度过高则会因▲导致目标产物的量▲。

(6)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA的方法。这两种引物分别为限制

性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1：50~1：100,在PCR反应的最初10~15个

循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA,但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导

的PCR就会产生大量的单链DNA。假设反应体系中原来有a个模板DNA,最初10个循环

扩增产生双链DNA,后20个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物▲个,需要非限制

性引物上个。因为双链DNA和单链DNA的▲不同,可通过电泳方法将其分离。

【命题角度9】实时荧光定量PCR

传统的PCR只有等扩增结束后，才能进一步检测目的DNA片段的产量；期望能够不等PCR扩

新的挑战

增结束，在PCR进行的过程中，就能定量判断扩增的进程，定量判断目的DNA片段的数量

固有条件PCR扩增仪、热稳定的DNA聚合酶、足量的dNTP、缓冲体系、Mg"等阳离子

解决策略▲

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［例1］实时荧光定量PCR简称qPCR,灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光

标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的

基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下

发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，

可得Ct值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述错误的是：

引物1®@

3’--------------------------------------y

5,-------------------------------------3*

施引物2

用

31----------------------5,

5,------------------31

注：R表示荧光基因，Q表示淬灭基因.

A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团

B.在反应过程中，无需ATP为新链的合成提供能量

C.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核甘酸序列合成引物和Taqman探针

D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小

【例2】“实时荧光定量RT—PCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1〜2h内即可得到检测结果。TaqMan

探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针（如图1），其5末端连接荧光基团（R）,3

末端连接淬灭剂（Q）o当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程

中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检

测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图2）。请据图回答：

病毒样品RNA-

I

MMa做针双链DNA一

@弓瞅探针与模悭显二

荧光基因（SB淬灭剂।引物2

帆延佛解解匕二.T还九

图］

Tao胸切割探针期Q1’7一

和聚合越EL।⑥

图2

（1）结合图1和图2分析，“荧光RT—PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有▲酶、▲

酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2\缓冲剂系等。这种分子层面的荧光RT—PCR检测具有

特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的▲、▲有关。

（2）根据TaqMan探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据工。新冠病毒（nCoV-2019）

是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的

相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计TaqMan探针时应筛选出nCoV-2019

特有序列，以避免▲（填“假阴性”或“假阳性”）的出现。

（3）根据图1和图2,Taq酶的除了能催化DNA子链的延伸，还能▲。

（4）若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a,则反应体系中某时刻荧光信号强度（Rn）

主要与▲、▲有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双

链”荧光信号的强度也等比例增加，加了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值

时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图（如右

图）。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中上等有限，超出一定的循环数后，荧

光标记的“杂交双链”不再增加。

,呼台期T

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