病毒及其疫苗的生产制备技术

25章病毒及其疫苗的生产制备技术第一节病毒的生产制备病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培育技术不成熟之前，人们为争辩病毒广泛的应用，为病毒的生殖、鉴定供给了来自不同动物〔包括人、不同组织的细胞来源，对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进展大规模生产。一、病毒生产的目的和用途1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或外表抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清〔抗体。2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。4、为了制备干扰素的病毒诱生剂ND、仙台病毒等，用于干扰素的生产。5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进展传播的病毒。这是战斗狂们正在开展的争辩，应警觉。二、病毒生产制备的方法1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒承受鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒NDV-、仙台病毒等，目前尚无敏感9～103772凝效价。Q7日龄鸭胚进展卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常承受10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。3、细胞培育法〔18〕心收获上清。以上病毒大量生产后可制作病〔死疫苗或减毒活疫苗剂或提取病毒外表抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类安康和生命。其次节病的生产制备预防的疫苗有灭活疫苗〔KilledVaccine〕,又称死疫苗，减毒活疫苗〔LiveVaccine〕,一、病的种类〔二倍体细胞与地鼠肾细胞可用于生产狂犬病病毒固定毒灭活疫苗病毒核酸而不影响其抗原性。腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及一些联合疫苗〔如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗。(三)亚单位疫苗：用化学试剂裂解病毒，提取包膜或衣壳上的亚单位，除去其核酸，以苗。HBsAg的乙型肝炎疫苗或承受基因工程法制备HBsAg成的减毒活疫苗称基因缺失的减毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶〔TK〕缺失株〔第一代〕和gp3区缺失株〔其次代，单纯疱疹病毒的22基因缺失株，目前有待进一步争辩。CHO细胞中抗原HBsAg的基因在酵母和CHOHBsAgHA、HBVI型和IIHSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒，经一次划痕接种可使机体同时能获得对多种病毒的免疫力，大大削减了接种次数。此外腺病毒和脊髓灰质炎病毒的活疫苗也可作为载体与轮状病毒的抗原基因重组后的活疫苗，经口服后可同时获得两种病毒的免疫力，有待于进一步争辩、开发。上述病有的是承受细胞培育技术和细胞工程来进展生产制备的程制备病种类和敏感细胞以及生产方式规于下表。〔如表25-。25-1承受细胞培育法生产的常用病疫 苗 制备疫苗

培育方法名 称 活/死(疫苗株) 的细胞脊髓灰 灭活〔Salk株〕 猴肾细胞〔原代/2-3代〕转瓶培育质炎疫苗腮腺炎疫 苗

活〔Sabin〕活〔ME〕Edomonste、

Vero幼地鼠、狗肾豚鼠肾细胞原代鸡胚纤维母

微载体培育转瓶培育罗氏瓶培育L16、沪191、细胞，人二倍体 罗氏瓶培育麻疹活疫苗 Moraten、Schwar2株

人羊膜、狗肾、羊肾豚鼠肾细胞

转瓶培育单纯疮疹病巨细胞病

死〔72〕活〔Towne〕

兔肾、豚鼠肾豚鼠胚成纤维细胞WI-38

罗氏瓶培育转瓶培育转瓶培育狂犬病死〔AV01/AV02〕人二倍体细胞〔CUS〕

微载体培育流行性乙型脑炎疫苗森林脑炎病

灭活〔5-3〕灭活

人二倍体细胞鸡胚纤维母细胞幼地鼠肾细胞

多层滋养增殖器转瓶培育三、用细胞培育制备病的优点：病的制备开头多用动物脏器、禽类胚胎〔第一代疫苗。然而因来源困难，很不经济，制作麻烦，数量受限，更危急的是这些组织中间可能含有潜在致癌病毒和慢性病毒，后改用原代细胞来制作疫苗〔其次代疫苗，如麻疹疫苗、乙脑疫苗等，随着细胞培育的进展70这比用原代细胞制备疫苗更优越。如：在细胞传代期间可进展比较全面的检查，特别是对潜在病毒和致癌性的检查，确保安全。可使渐渐适应于无血清〔或无蛋白〕培基中生产生殖，以排解过敏因素。可选择对病毒敏感的细胞克隆。以利病毒在细胞中大量增殖，有助于疫苗产量的提高。易于大量生产和进展连续自动化工业生产，以满足量的需求。WI-38、MRC-5、IMR-90KMB-17、2BS、SL-7等均已用于疫苗生产，如麻疹活疫苗、乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、腮腺炎疫苗等，从有一些病的制备还需用原代细胞，近年来有人主见用肿瘤细胞制备人用灭活疫苗。四、提高疫苗的效力常承受的方法：细胞的药物处理：用某些药物处理细胞后可以刺激病毒生殖〔如下表，其方法为：在细胞形成单层后，用一些化学药物来处理，然后洗去，再接种病毒，就可使病毒提前成熟，产量高，现列表如下：处理细胞的药物5-碘-2-脱氧尿核甙维生素ATween-80

刺激的病毒风疹、腺病毒、巨细胞病SV-40脊髓灰质炎病毒、滤泡性口腔炎病毒胆固醇或卵磷质DEAE-dextran胰 酶二甲亚砜放线菌素D

脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒、风疹痘类病毒，付流感病毒痘类病毒、呼吸道肠道病毒，流感病毒、鼻病毒脊髓灰质炎病毒、流感、疱疹病毒麻疹、脊髓灰质炎病毒、付流感病毒在维持液中补充某些物质也有利于某些病毒的复制、列表如下：增加的药物Tween-80

乙型脑炎

刺激的病毒谷氨酰胺精氨酸脯氨酸、赖氨酸

麻疹、脊髓灰质炎病毒、仙台病毒痘类病毒、疱疹病毒乙型脑炎毒种的选择：经过空斑选择产量高的大空斑毒株，精制毒种可提高病毒产量。病毒液的浓缩：经浓缩后，病毒浓度增高，从而效价也随之上升。五、影响疫苗质量的因素：毒种：毒种的优劣不仅影响疫苗的产量，而且也影响疫苗的质量，毒种不纯会产免疫效价高而长久，抗原谱广的，易增殖，便于生产，可在传代细胞上传代的毒种。培育病毒的细胞：细胞假设有潜在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原体污染均不能用作疫苗生产。对此因素应严格检查。此外假设细胞本身发生转化后，不宜于制备活疫苗，只能制备一些灭活疫苗或亚单位疫苗。培育液：培育细胞的养分液中多少含有肯定量的血清蛋白，在疫苗使用中常会出甲醛灭活剂的使用：甲醛能使病毒灭活，但仍保持其抗原性，因此普遍用来制备灭活病，但要把握含量。病毒被灭活的程度与灭活的温度和甲醛的浓度等因素有亲热关系。一般用热灭活的方法，承受在37℃灭活肯定时间。经热灭活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和稳定性不受影响，而且灭活病毒的温度提高以后，灭活时间相对可以缩短，灭活剂的用量也可以削减。中和甲醛。这对削减注射后苦痛及便于推广预防接种有重要意义。六、生产病毒和制备病的常用方法(一)制备工艺流程〔1〕脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺猴肾细胞培养←接种病毒〔0%正常细胞比照〕收获病毒，合并，加MgCl→2无菌试验→←猴病毒检查〔获肾细胞B〔兔肾细胞〕→←病毒效价滴定←合并，过滤加MgCl2←无菌试验分亚批→←柯萨奇病毒检查〔乳鼠〕病毒滴定→←型特异性检查B〔家兔〕→←T分装病毒滴定→←猴体剩余致麻痹力试验〔安全试验〕病理切片结核杆菌检查→分装→←无菌试验病毒滴定→保存于-20℃待检定合格后加工糖丸脊髓灰质炎活疫菌工艺流程2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺地鼠肾剪碎，胰酶消化地鼠肾细胞悬液37℃,3天细胞培育液，pH7.0～pH7.2单层细胞洗涤细胞，去除牛血清10-4～10-5浓度病毒感染细胞32～342～3收获病毒液〔收二次〕1:202322℃，8灭活病毒液合并，安全及效力试验原液参加亚硫酸氨钠半成品分装成品检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验，防腐剂、试剂及剩余牛血清含量等〕合格成品(二)生产方法：胞大量生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病培育装置，如转瓶培育，因设备简洁，便于生产单位承受。而多层培育，微载体培育，目前生产病毒的技术。1、微载体悬浮培育细胞的病毒生产工艺作者选VSV病毒来接种经微载体培育的敏感细胞，病毒的效价测定用A549细胞〔也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID，病毒的效价为6Log

/m L，50 50用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。①VSV〔100mL10mL〕待BHK21、BHK13、CHO-K110-2VSV0.2ml，37℃120-30℃冻存，待测效价。②VSV微载体培育的BHK21BHK13、或CHO-K细胞，13～41×106细胞/mL30尽量吸去原培育基37℃10-2VSV50mL1mL37℃50r/min51〔202〕参加病毒维持液至原体积37℃连续20于-30℃冻融后2023r/min10收集上清，即为VSV增殖的病毒液，分装冻存，待测效价VSV病毒不仅产量大，而且病毒效价平均高1LogTCID50

，尤以CHO-K1

效价最高，平均可达7.75logTCID50

比原先的毒种效价还要高1.75LogTCID，又起到了提高病毒效价的作用。50此方法也可应用于生产病，只要疫苗株病毒的敏感细胞能在微载体上大量生产。此法生产的病毒可用甲醛灭活法制备死疫苗。2、转瓶培育法，麻疹疫苗等。将细胞制备成悬液后，在温室内〔37℃〕8～12转/小时缓慢转动，以使细胞贴壁，当参加病毒后，