基因工程知识点总结归纳更新版

基因工程绪论克隆〔clone〕：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的别离和重组的过程。基因工程〔geneengineering〕：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。基因工程诞生的根底三大理论根底：40头觉察了生物的遗传物质是DNA；50头弄清晰DNA的双螺旋构造和半保存复制机理；60头确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。三大技术根底：限制性内切酶的觉察；DNA连接酶的觉察；载体的觉察基因工程的技术路途：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶限制性内切酶〔restrictionenzymes〕：主要是从原核生物中别离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。限制酶的命名：属名〔斜体〕+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均一样的限制酶。5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生一样的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。6、限制性内切酶的活性：在适当反响条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物，所须要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。7、星号活性：变更反响条件，导致限制酶的专一性和酶活力的变更。8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反响是吸能反响，最适反响温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进展第二链的合成。11、DNA聚合酶：(1)、DNA聚合酶I：5’—3’外切酶活性、3’—5’外切酶活性，5’—3’聚合酶活性，用处：除去3’端突起。补齐5’端突起。合成cDNA第二链。切口移位探针的制备。(2)、Klenow大片段：没有5’→3’外切酶活性，而保存了5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。用处:用同位素标记具5’端突起的DNA片段末端。补平5’粘性末端。DNA序列测定。合成cDNA第二链。(3)、Taq酶：75度为最适反响温度，95度仍具有稳定性，不具有外切酶活性，主要用于PCR。主要修饰酶：(1)碱性磷酸酶：除去核酸分子3’和5’端的磷酸基团。(2)T4多聚核苷酸磷酸激酶：催化ATP中的γ位的磷酸基转移5’-OH上(3)末端脱氧核苷酸转移酶：在3’端高效添加脱氧核苷酸。分子克隆载体分子克隆载体：是一类可供外源DNA片段插入并携带重组分子进入宿主细胞进展扩增或表达的DNA分子。分子克隆载体的功能：为外源基因供应进入受体细胞的转移实力为外源基因供应在受体细胞中复制或整合的实力为外源基因供应在受体细胞中扩增和表达的实力载体的分类：按用处分：克隆载体、表达载体、整合载体按来源分：原核生物载体：质粒载体、λ噬菌体载体、M13噬菌体载体、cosmid载体、phagemid载体；真核病毒载体载体的特点：至少有一个复制起点，因此至少可在一个生物体中自主复制至少有一个克隆位点，可供外源DNA插入至少有一个标记基因，以学问载体或重组DNA分子是否进入受体细胞具有较小的分子量和较高的拷贝数标记基因的作用：外源基因是否插入载体分子形成重组子；外源载体是否进入宿主细胞标记基因的种类：抗性标记基因；养分标记基因；生化标记基因；噬菌斑常用的遗传标记基因：四环素抗性基因〔Tc〕；氨苄青霉素抗性基因〔Ap〕；氯霉素抗性基因〔Cm〕；卡那霉素〔Kan〕；新霉素〔Neo〕；β—半乳糖甘酶基因〔LacZ)；葡萄糖苷酸酶基因〔Gus〕；荧光素酶基因；发光蛋白质基因。按复制起点划分克隆载体：质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体〔有低拷贝和高拷贝〕ARS复制型—染色体复制型〔一般拷贝数比较高〕病毒复制型—复制起点来自病毒，假设为RNA必需反转录为cDNA〔高拷贝〕混合复制型：不同种生物复制起点混合〔穿梭载体〕根据载体的分子生物学特性划分：质粒载体、病毒型载体、混合型载体根据载体功能分类：1〕一般型载体：至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因。如PBR322和pUC载体2〕表达型载体：3类：Ⅰ型：转录起始区〔调控序列+启动子〕+终止子；Ⅱ型：转录起始区+翻译起始区〔核糖体结合序列和起始密码子〕+终止子；Ⅲ型:转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子〔常称之为表达分泌型载体〕3〕失控型质粒载体(Run-awayplasmidvector)：是一些低拷贝质粒，其复制限制是温度敏感型或药物敏感型，在不同温度或不同药物浓度下，质粒拷贝数会显著变更。4〕探针型载体：该类载体主要特点是含有一些特别的DNA序列，用于特定的探讨目的，如别离基因启动子、终止子、DNA复制起点等。5)定序型载体：主要用于核苷酸的序列测定6)整合型载体：主要用于基因治疗，稳定表达外源基因。9、标记基因与拷贝的关系：假设标记基因的表达效率较高，宿主细胞可能不大量表达标记基因以满意选择压力的要求，因此载体的拷贝数会降低，可实行相应方法进步拷贝数。如：对于药物抗性标记基因，可进步药物的浓度。对于养分标记基因，可降低该基因的表达效率。大肠杆菌分子克隆载体克隆载体的种类1〕质粒载体—复制起点来自一些自然质粒。2〕噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。3〕COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段，以利于体外包装4〕噬粒载体〔phagemid〕—有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。质粒的特点：质粒DNA的复制与染色体复制无关质粒DNA以超螺旋形式存在质粒DNA可以结合转移质粒的不相容性和不相容群质粒DNA的消退质粒的整合大肠杆菌质粒的复制：以RNAⅡ为引物合成，RNAⅠ与RNAⅡ结合可削减质粒的拷贝数，使RNAⅠ复制起点上游一个核苷酸处G突变为T，使得拷贝数增多。质粒的不亲和性：在没有选择压力的状况下，两种亲缘关系亲密的不同质粒，不行以在同一宿主细胞中稳定共存的现象。主要是由于他们在复制功能之间的互相干扰造成。λ噬菌体的构造特点：线性双链DNA病毒，具有末端互补的12个核苷酸，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48.5kb。热诱导表达：λclts857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在λclts857下游，重组体的目的基因在42℃表达，30℃不表达。λ噬菌体载体的缺点：基因组太大；酶切点太多；野生型只能接纳确定长度的DNA。λ噬菌体载体的改造：切去非必需片段，加载目的基因去掉太多的酶切位点增加标记基因COS质粒载体的特点：在一般质粒载体中插入一个或两个来自λ的cos位点片段，双cos载体比单cos载体易于重组。COS质粒载体的优点：容量大，用于基因簇的克隆；形成的重组DNA分子可进展体外包装，并能感染大肠杆菌细胞；操作简洁，易于转化细胞；对重组DNA分子长度具有选择性包装。噬粒载体〔phagemid〕：在质粒载体中插入一段M13或fd的复制起点，其插入方向确定在噬菌体颗粒中形成正链还是负链。基因操作的主要技术原理核酸别离提取的原则：保证核算的一级构造的完好性；解除其他分子的污染质粒载体别离的关键：如何使质粒与DNA与宿主染色体DNA分开根据：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA提取过程中，染色体断裂成片段，而质粒DNA仍保持超螺旋构型3、变性法提取质粒DNA的原理：在变性条件〔碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件复原时，质粒DNA快速复性复原自然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状构造，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。RNA别离纯化的关键：防止内外源RNase的作用RNase的特点：抗酸抗碱；抗高温寒冷；抗变性剂，酶活性不须要扶植因子，存在范围广。因此操作时要进展高温灭菌或用焦碳酸二乙酯处理或强蛋白质变性剂等。核酸的浓缩：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的盐离子和杂质。核酸凝胶电泳的根本原理：核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极挪动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分子别离，分子量小的DNA，具有较严密的构型，在凝胶中挪动快；反之，分子量大的DNA挪动慢。核酸凝胶电泳常运用溴酚蓝作为指示剂、溴化乙锭作为染色剂9、脉冲场凝胶电泳原理：加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的DNA分子用于变更泳动方向的时间不同，则可以得到别离10、双脱氧核苷酸终止法的原理：双脱氧〔2'，3'〕-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样干脆掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列11、双脱氧核苷酸终止法的过程：制备单链DNA，与引物退火，分为4个反响体系，每个体系中参与dNTP和一种双脱氧核苷酸，DNA聚合酶定序反响，反响产物变性后电泳，凝胶枯燥，放射自显影，根据条带读出碱基序列，再根据碱基互补配对原则写出DNA链的序列。〔留意：要自己写一个序列，然后写上每个体系中出现片段的序列，然后根据序列画出电泳图，考试考的可能性大，书上有步骤〕12、Maxam-Gilbert化学法原理：DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反响，在碱性环境下硫酸二甲酯能使碱基G发生甲基化，在酸性环境下哌啶甲酸使A和G脱嘌呤，碱性环境下肼使C和T发生开环，在高盐浓度下肼只使C开环。然后发生1~2个碱基的脱落或取代，最终发生链断裂，不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列13、化学法测序的优点、不须要模板、引物和DNA聚合酶。14、Southern杂交〔Southernblot〕：用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳别离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。Southern杂交的一般步骤：DNA的制备→DNA酶切→电泳〔琼脂糖凝胶电泳〕→DNA原位转膜→探针杂交→放射自显影→结果分析Northern杂交检测的是RNA。步骤与southern类似，不须要酶切。Western杂交：杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反响进展检测。主要用于基因表达产物蛋白质的检测。Western杂交的一般步骤：蛋白质制备→SDS→电转移至膜上→一抗的制备→一抗与膜结合〔1h〕→洗膜〔30min〕→二抗与膜的结合→洗膜→显色反响→结果分析17、PCR反响体系：模板、引物、dNTP、buffer、taq酶、超纯水。18、引物设计的一般原则：引物的长度常为17至30个碱基；GC含量为40%至60%；Tm值高于55；两条引物之间配对碱基数小于5；引物自身配对的碱基数小于3。基因文库的建立基因组文库：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。建立基因组文库的一般程序:载体DNA片段的制备：DNA别离，限制酶切割，脱磷酸化反响供体DNA片段的制备：总DNA纯化，再进展机械或酶切割成特定大小的DNA片段。供体和载体DNA的连接:要留意混合的比率和浓度重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增基因组文库质量的评价：文库规模、重组频率利用λ载体构建基因组文库:载体DNA片段的制备的方法：左右臂DNA片段的获得供体DNA片段的制备：限制酶部分酶切，机械剪切法重组DNA分子的形成：限制混合的比率重组DNA分子的包装：制备包装物，然后进展包装基因组文库的扩增为进步文库的质量，实行以下措施:双酶切载体产生不同末端以防止其自身形成串状体供体DNA脱磷酸化以防止供体DNA间的连接导致重排载体和供体DNA末端修饰以防止上述两种情形发生:载体补CT，供体补GA承受文库快速构建法以防止扩增文库时DNA丢失基因组文库的载体可载入DNA大小：质粒最大15kb相宜构建cDNA文库；亚克隆噬菌体最大25kbcDNA文库COS质粒30-45kb基因组文库噬粒最大12kbcDNA文库P170-90kb基因组文库BAC100-500kb基因组文库YAC250-1000kb基因组文库鸟枪法克隆目的基因：随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的选择程序从众多克隆中别离出含有目的基因的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆别离。鸟枪法克隆基因的步骤：染色体DNA的切断；与载体连接；转化受体细胞；选择含有目的基因的目的重组子。鸟枪法的改良:目的基因的酶切图谱；在连接前将DNA片段进展分级别离鸟枪法克隆基因的局限性：工作量较大，须要理解目的基因的背景学问不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结果cDNA文库：从确定生长阶段或条件的某种细胞别离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增值所产生的无性繁殖系的总和。cDNA文库的特点：基因特异性；器官特异性；代谢或发育特异性；不匀整性；cDNA均可获得表达建立cDNA文库的一般程序载体DNA片段的制备多聚〔A〕RNA的别离制备双链cDNA的合成：反转录法合成单链cDNA，碱解或酶解除去RNA合成第二链ds-cDNA与载体DNA相连：人工接头、同聚物加尾、cDNA的定向插入重组cDNA分子的转移和文库的建立:质粒载体则转化大肠杆菌、噬粒则包装感染第二链合成的方法：自身引导法、置换合成法、引导合成法。前两者5’端会有几个碱基缺失。目的基因的别离和鉴定获得基因的一般方法：化学合成法:主要用于较小基因的合成或须要变更碱基半化学合成法：mRNAcDNA加人工接头或合成一段DNA与载体相连、选择法：用各种方法从基因文库或cDNA文库中选择目的基因基因选择的方法:遗传互补法原理：当一外源DNA片段引入一受体细胞后，假设受体细胞获得某种新的性状，则此片段上携带着确定新性状的遗传基因。养分缺陷型受体细胞转入外源DNA片段之后，涂布在合成培育基上可以生长；无某种表型的细胞会有新性状；某些产酶细胞则可能过量产酶。酿酒酵母MFα基因的选择：基因组文库DNA转化酿酒酵母细胞在缺乏亮氨酸的培育基上培育能生长的重组子即含合成亮氨酸的基因核酸杂交法原理：利用核酸探针与待别离DNA的同源序列可进展杂交的特点别离目的基因。别离步骤：基因(基因组或cDNA)文库→制备DNA样品膜→与标记探针杂交→杂交斑点〔阳性克隆〕→别离重组DNA分子→作斑点杂交→阳性克隆→Southern杂交以确认杂交结果→DNA进一步证明和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级构造比较；别离插入片段进展基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物。免疫法原理:外源DNA引入宿主细胞后表达出蛋白质，以此蛋白质为抗原与相应抗体发生免疫反响，然后利用二抗与一抗反响，用二抗偶联的酶反响选择目的基因。别离步骤:基因文库→蛋白质样品膜制备→免疫法选择→有色斑点〔阳性克隆〕→进一步证明：别离阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹，western印迹免疫分析；别离重组DNA，检测插入片段大小，测序等。染色体巡查法蛋白质-DNA杂交法蛋白质-蛋白质结合法，即酵母双杂交法原理：利用酿酒酵母的GAL4蛋白质N端和C端分别交融的两种蛋白质互相作用可激活具有UAS〔上游激活序列〕报告基因表达选择目的基因的方法。GAL4蛋白质基因是一个调控基因，限制半乳糖利用酶类基因的表达，其5’端存在UAS。GAL4存在两个构造域：N端具有UAS-DNA结合域〔BD〕，C端具有转录激活构造域〔AD〕，这两个构造域可以单独起作用。假设AD和BD分别与两个基因编码序列交融，且两种蛋白质能互相作用，就可导致GAL-LacZ基因的表达。与BD交融的基因称为钓饵基因，与AD交融的基因称为目的基因。用于基因别离和鉴定的扶植方法：抑制消减杂交法；差异杂交法；阻断翻译法；释放翻译杂交法植物基因工程植物组织培育技术：愈伤组织培育、细胞悬浮培育、原生质体、植株再生植物基因转移方法：农杆菌转化法、基因枪法、原生质体法、电击法、显微注射法植物转化的标记基因：选择标记基因〔kan、Hyg、Bar〕、报告基因〔Bt、Gus、GFP〕、启动子〔CaMVA)Ti质粒有六个功能区：致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解Ti质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移毒性区〔Vir〕：干脆参与T-DNA的转移和插入植物染色体DNA复制区〔Rep〕：参与Ti质粒DNA复制将致瘤区交换成目的基因即可取出冠瘿根瘤农杆菌转化的一般步骤：叶盘法：从植物叶片上用打孔器取假设干叶片→制备含有目的基因的Ti质粒→将质粒转入农杆菌→置于含农杆菌的培育基24小时→将叶片转移至选择培育基上→诱导愈伤组织→诱导生根→移栽转基因技术在植物中的应用：抗虫、抗病毒、抗真菌、抗除草剂、抗逆、改良作物品种转基因植物的问题：转基因缄默：位置效应、转录程度的基因缄默、转录后程度的基因缄默。选择基因平安性问题；对生态环境的影响动物基因工程从遗传学角度划分：遗传性动物基因工程、非遗传性动物基因工程2、动物基因工程载体具备的功能：为外源基因供应进入受体细胞的转移实力为外源基因供应在受体细胞中复制或整合的实力为外源基因供应在受体细胞中扩增和表达的实力动物基因工程载体：质粒型载体、病毒型载体、定向打靶载体〔基因敲入、基因敲除、基因下调〕哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记：遗传标记编码产物选择药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸复原酶氨甲喋呤DHFR突变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A基因转移技术：物理转染法：电击法、显微注射法、基因枪法、超声波法化学转染法：磷酸钙法、脂质体法、原生质体法生物法：病毒感染法转基因动物制备程序：DNA显微注射法制备转基因小鼠：基因制备→促排卵→结扎、假孕鼠→取受精卵→显微注射DNA→胚胎移植→基因分型分析胚胎干细胞制备转基因动物过程：转基因胚胎干细胞的获得→胚囊注射→嵌合体的检测和育种转基因体细胞核移植法消费转基因动物转基因的鉴定：标记选择法：正负选择标记选择法、无启动子选择法分子鉴定法：PCR扩增、斑点杂交、Southern杂交、荧光原位杂交表达程度的检测：报告基因、Northern杂交、反转录P