DB23T 3767-2024奶牛趾间皮肤外植体构建技术规程

ICS65.020.30CCSB44232024-08-30发布IDB23/T3767—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省农业农村厅提出。本文件起草单位：黑龙江八一农垦大学、东北农业大学、黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院。本文件主要起草人：郑家三、刘云、邵广、张鹤飞、周志新、葛延松、徐恩爽、韩欢胜、王峥、孙悦、杨春雪、田雪。DB23/T3767—2024近年来，在市场和政策的推动下，以及地处北纬43～53°世界公认的黄金“奶牛带”这一得天独厚的资源优势，黑龙江省奶牛规模养殖发展速度迅速，随之而来的是一些奶牛群发生产疾病特别是奶牛肢蹄病的发病率呈上升趋势，对我省奶牛养殖行业的健康发展造成了巨大的威胁。在奶牛肢蹄病中蹄病发病率约占90%以上，根据表现形式可分为感染性和非感染性两类，常见的感染性蹄病主要包括腐蹄病、蹄趾皮炎和趾间皮炎等，奶牛蹄病一直是困扰奶牛健康养殖的难题，深入阐明奶牛蹄病的病原易感性及其炎症发生机制是十分必要的。以往对奶牛蹄部感染性疾病的研究往往采用活体实验，不仅给实验带来诸多不便，而且实验成本高昂，更重要的是违背动物福利原则，因此寻找一种可替代的离体实验模型具有重要的现实意义，基于以上目的，本文件提出构建奶牛趾间皮肤外植体。3DB23/T3067—2024奶牛趾间皮肤外植体构建技术规程本文件规定了奶牛趾间皮肤外植体的来源、采样、构件材料、活性检测方法、构建成功评定方法的要求。本文件适用奶牛趾间皮肤外植体的构建。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB16568-2006奶牛场卫生规范DB2306/T096-2019《奶牛蹄部疾病诊断技术规程》DB23/T1618-2015奶牛蹄保健技术规范DB61/T367.16-2022荷斯坦牛生产技术规范第16部分：肢蹄病防治GB/T27830-2011化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验方法SN/T4577-2016化妆品皮肤刺激性检测重建人体表皮模型体外测试方法JY0315-1991皮肤结构模型技术条件3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1皮肤外植体从活体动物切取下来进行培养的皮肤组织。4要求4.1外植体皮肤来源要求4.1.1以新屠宰的奶牛后蹄趾间皮肤为外植体皮肤来源。4.1.2外植体所用的皮肤需从无蹄部疾病且蹄型结构良好的奶牛后蹄蹄叉处采集。4.2人员要求4.2.1具有扎实的兽医外科专业知识，且熟练掌握兽医外科手术操作技能。4.2.2熟练掌握组织/细胞培养技术。4.2.3熟练掌握病理组织学和免疫组织化学技术并具有分析病理组织切片的能力。4.3采样要求4DB23/T3067—20244.3.1使用的外科手术器械应经过严格消毒、灭菌。4.3.2样品采集过程保证无菌操作。5奶牛趾间皮肤外植体构建材料5.1主要材料奶牛趾间皮肤外植体构建所用耗材见附录A。5.2主要设备奶牛趾间皮肤外植体构建所用主要设备见附录B。5.3奶牛趾间皮肤外植体构建方法5.3.1培养基配制5.3.1.1运输培养基每100mL运输培养基中，含有青霉素-链霉素-两性霉素B溶液（100×)1mL、L-谷氨酰胺溶液1mL、5µg/mL硫酸庆大霉素9µL，余量为DMEM/F121:1培养基。5.3.1.2洗涤培养基每100mL洗涤培养基中，含有青霉素-链霉素-两性霉素B溶液（100×)1mL、2µg/mL硫酸庆大霉素4µL，余量为DMEM/F121:1培养基。5.3.1.3组织培养基每100mL洗涤培养基中，含有青霉素-链霉素-两性霉素B溶液（100×)1mL、L-谷氨酰胺溶液1mL、5µg/mL硫酸庆大霉素10µL，胎牛血清10mL，DMEM高糖培养基65.993mL，余量为DMEM/F-121:1培养基。5.3.2样本的采集选取无蹄部疾病且蹄型结构良好的新屠宰奶牛。首先用刷子对蹄部表面进行刷洗，流水冲洗直至表面无粪便、泥土等污物附着，然后用2%葡萄糖盐酸氯己定冲洗蹄部8～10次，随后用75%酒精擦拭过的电推剪除去奶牛趾间皮肤被毛，用无菌手术刀片刮净残留毛发，75%酒精喷洗奶牛趾间皮肤8～10次后，使用8.0mm皮肤打孔器收集奶牛蹄部趾间皮肤。5.3.3运输将收集到的奶牛趾间皮肤放入一次性无菌培养皿中，加入含有1%青霉素-链霉素的PBS磷酸缓冲溶液中，反复洗涤至没有血液后，立即放入装有运输培养基的容器中，随后放入装有冰袋的保温箱中运输回实验室。5.3.4奶牛趾间皮肤外植体的组装5.3.4.1将装有奶牛趾间皮肤的容器放入灭菌后的超净工作台上，取出奶牛趾间皮肤，使用无菌手术剪去除趾间皮肤多余的皮下脂肪，75%酒精涮洗3次，然后浸入预热至37℃的洗涤培养基中洗涤3次，每次洗涤时间为15min。5DB23/T3067—20245.3.4.2取500μL体积分数为1.2%的琼脂糖置于12孔培养板最下层作为底座，目的是为奶牛趾间皮肤外植体提供物理支撑，在其上覆盖0.5cm2无菌手术纱布，将洗涤后的奶牛趾间皮肤置于纱布之上5.3.4.3在12孔培养板内添加组织培养基至奶牛趾间皮肤的表皮与真皮交界处，形成气相与液相交替的培养系统。将组装的奶牛趾间皮肤外植体置于37℃、5%CO2湿化培养箱中培养，每12h更换1次培养基。5.3.4.4按照本方法组装的奶牛趾间皮肤外植体培养24h时表皮结构完整，真皮层胶原纤维排列紧密，未见明显病理变化，可用于体外研究，体外模型构建成功。5.3.5奶牛趾间皮肤外植体活性检测及构建成功的评定方法奶牛趾间皮肤外植体活性检测及构建成功的评定方法见附录C。图1皮肤趾间皮肤外植体模型组装图6DB23/T3067—2024奶牛趾间皮肤外植体构建材料奶牛趾间皮肤外植体构建材料见表A.1。表A.1奶牛趾间皮肤外植体构建材料7DB23/T3067—2024奶牛趾间皮肤外植体构建主要设备奶牛趾间皮肤外植体构建主要设备见表A.2。表A.2奶牛趾间皮肤外植体构建主要设备8DB23/T3067—2024（资料性）奶牛趾间皮肤外植体活性检测及构建成功的评定方法C.1奶牛趾间皮肤外植体活性检测C.1.1HE染色法检测奶牛趾间皮肤外植体病理变化C.1.1.1皮肤组织切片制作按上述文件外植体的构建方法培养0、12、24、36、48和72h后收集奶牛趾间皮肤外植体，固定于4%多聚甲醛中。将经过甲醛固定的奶牛趾间皮肤外植体经流水冲洗4h后，分别在75%、85%、95%、100%酒精中浸泡1h进行脱水处理，在二甲苯中浸泡1h30min进行透明处理，最后在65℃浸蜡1h30min进行包埋，包埋好的组织块即可按需要制作石蜡组织切片。C.1.1.2HE染色按照HE染色试剂盒说明书的步骤进行染色，封片后显微镜下观察组织切片，检测奶牛趾间皮肤外植体病理变化。C.1.2Caspase-3蛋白表达检测C.1.2.1皮肤组织切片制作同C.1.1.1。C.1.2.2免疫组化C.1.2.2.1caspase-3是细胞凋亡信号转导通路中的重要成员之一，在细胞凋亡早期被激活。FasL与靶细胞表面的Fas结合后通过Fas分子胞内段的死亡结构域激活caspase-8，引起caspase酶级联反应，最后激活内源性DNA内切酶，诱导靶细胞的凋亡；颗粒酶通过靶细胞细胞膜上穿孔素形成的小孔进入细胞内，激活caspase-10，也能引起caspase酶级联反应，诱导靶细胞的凋亡；线粒体损伤时，位于线粒体内膜和外膜间的细胞色素c会被释放到细胞质中，与Apaf-1结合，继而激活caspase-9，引起caspase酶级联反应，诱导靶细胞的凋亡。由caspase-8、caspase-10和caspase-9启动的caspase酶级联反应都需要首先经过caspase-3传导凋亡信号。所以，可以通过检测caspase-3活化的来证明发生细胞凋亡。C.1.2.2.2按照SP检测试剂盒说明书的步骤对组织切片进行免疫组织化学染色，封片后显微镜下观察，对奶牛趾间皮肤外植体中Caspase-3凋亡蛋白的阳性表达进行检测。选取不同培养时期皮肤组织切片高倍（400×)视野各3张，使用Fiji/ImageJ-win64软件对视野下的阳性细胞和总细胞进行计数，并根据公式阳性率＝阳性细胞数/细胞总数×100%，计算阳性率。C.1.3TUNEL细胞凋亡检测C.1.3.1皮肤组织切片制作同C.1.1.1。9DB23/T3067—2024C.1.3.2TUNEL染色C.1.3.2.1TUNEL染色法是通过识别发生断裂DNA末端游离的3'-OH检测细胞凋亡的免疫组化技术，因其操作简单、应用范围广泛及检测结果灵敏等特点已成为实验室、动物模型和临床研究中检测细胞凋亡的首选方法。C.1.3.2.2按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书的步骤对组织切片进行染色，随后封片显微镜下观察，对奶牛趾间皮肤外植体中细胞凋亡的阳性表达进行检测。选取不同培养时期皮肤组织切片高倍（400×)视野各3张，使用Fiji/ImageJ-win64软件对视野下的阳性细胞和总细胞进行计数，并根据公式阳性率＝阳性细胞数/细胞总数×100%，计算阳性率。C.2奶牛趾间皮肤外植体构建成功评定方法C.2.1奶牛趾间皮肤外植体病理变化HE染色结果如图C.1所示，对照组0h皮肤组织的表皮完整，各层结构清晰可见；真皮层的结缔组织排列规则；肌层的肌纤维紧密排列，毛囊、皮脂腺及汗腺等散在分布，真皮层中可见少量的淋巴细胞（C.1（a））。与之相比试验组各培养时期皮肤组织的表皮层均发生不同程度角化过度，真皮层胶原纤维紊乱并伴有不同程度中性粒细胞浸润等病理变化，除72h皮肤组织表现为中度炎症反应外，其余均表现为轻度炎症反应。12h和24h皮肤组织的表皮结构完整，真皮层胶原纤维排列紧密，无明显病理变化（图C.1（b）和（c36h皮肤组织角质层呈网篮状，偶见上皮细胞变性（图C.1（d48h皮肤组织可观察到大量上皮细胞变性及少量上皮细胞坏死，同时伴随细胞核固缩（图C.1（e72h皮肤组织可见表皮脱落、缺失，毛囊、皮脂腺等皮肤附属器官发生程度不同的坏死（图C.1（f。HE染色结果表明，奶牛趾间皮肤外植体在培养24h组织结构完整，并未出现明显病理变化；培养36h出现细胞凋亡早期的变性迹象，提示此时已不适用于体外研究。标引序号说明：a～f依次为0、12、24、36、48及72h奶牛趾间皮肤外植体；蓝色箭头所指：真皮层淋巴细胞浸润；DB23/T3067—2024黑色箭头所指：表皮层角化过度；红色箭头所指：毛囊、汗腺、皮脂腺坏死；绿色箭头所指：细胞变性、坏死，细胞核固缩。图C.1奶牛趾间皮肤外植体病理变化（HE×200）C.2.2奶牛趾间皮肤外植体Caspase-3蛋白表达情况免疫组化结果如图C.2所示，对照组0h奶牛趾间皮肤外植体中可见轻微的Caspase-3蛋白阳性表达；试验组12、24、36、48和72h奶牛趾间皮肤外植体表皮及真皮中Caspase-3蛋白明显呈阳性表达，根据分布情况可知，表皮中Caspase-3蛋白阳性表达情况高于真皮；体外培养72h内奶牛趾间皮肤外植体凋亡细胞数量从0.86%上升至46.96%，说明体外培养时间越长，细胞凋亡阳性率越高。免疫组化结果表明，体外培养时间越短，细胞凋亡阳性率越低，结合HE染色结果，确定奶牛趾间皮肤外植体培养24h是体外研究的最佳时间。标引序号说明：a～f依次为0、12、24、36、48及72h奶牛趾间皮肤外植体；黄色为DAB显色下Caspase-3蛋白阳性表达细胞。图C.2奶牛趾间皮肤外植体Caspase-3蛋白表达（DAB×400）C.2.3奶牛趾间皮肤外植体凋亡细胞表达情况TUNEL染色结果如图C.3所示，对照组0h奶牛趾间皮肤外植体可见少量细胞发生凋亡；试验组12、24、36、48和72h的奶牛趾间皮肤外植体表皮和真皮中凋亡细胞呈明显阳性表达，根据分布情况可知，表皮中凋亡细胞数量高于真皮；细胞凋亡阳性率