DB23T 3733-2024 红松无性系SSR鉴别技术规程

ICS65.020.01CCSB60

DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准DB23/T3733—2024红松无性系SSR鉴别技术规程2024-8-30发布 2024-9-29施黑龙江省市场监督管理局 发布DB23/T3733—2024DB23/T3733—2024前 言GB/T1.1-20201本文件由黑龙江省林业和草原局提出。本文件由黑龙江省林业和草原局标准化技术委员会归口。本文件起草单位：东北林业大学、佳木斯市孟家岗林场、苇河林业局青山林木种子园、宁安市渤海林木种子园、五常市宝龙店种子林场、鹤岗市林木良种繁育中心。本文件主要起草人：张含国、闫平玉、张磊、孙国飞、潘凤刚、李金泉、石宝英、胡振宇、曹振宇、李志新。DB23/T3733—2024DB23/T3733—2024PAGEPAGE1红松无性系SSR鉴别技术规程范围本文件规定了红松（PinuskoraiensisSiebold&Zucc.）无性系SSR鉴别技术中技术原理、仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序、数据记录与统计、判定规则及档案管理等要求。本文件适用于红松无性系的SSR指纹数据采集及品种鉴定。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法下列术语和定义适用于本文件。快速、准确、稳定鉴定无性系的SSR引物。核心引物检测出不同无性系差异位点数小于2时可选择的引物。DNA：DeoxyriboNucleicAcidPCR：PolymeraseChainReactionSequenceRepeatsDiamineAcidtriphosphatePAGE：PolyacrylamideGelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳。CTAB：HexadecyltrimethylammoniumBromide十六烷基三甲基溴化铵。TBE：Tris-Borate-EDTAbuffer-硼酸-乙二胺四乙酸二钠缓冲液。由于不同红松无性系遗传组成不同，基因组DNA中SSR的重复次数存在广泛差异。简单重复序列差异可以通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而区分不同红松无性系。PR扩增仪；电泳仪（具有恒电压、恒电流功能；垂直电泳槽及配套的制胶附件；水平电泳槽及配（1500g（0.125、20、20、100L800（含2+25oL；NPAA标准；核酸染色剂；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二苯甲青；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；无水乙醇；DNA0.5oLCI25L（3~800。TE：1mol/LTris-HCl5mL，0.5mol/L1mL0.5mol/LHCIpH8.0500mL。0.5mol/L186.1g800mLpH8.0，1L1mol/LTris-HCI溶液：60.55g三羟甲基氨基甲烷溶于适量水中，加0.5mol/LHCI溶液调pH至8.0定容至500mL，高压灭菌。81.7g20g1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/L401L，4℃PCRSSR引物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均10μmol/L的工作液。（×9，0.5oL的A1L.125g0.125g。30%PAGE胶：丙烯酰胺290g，甲叉双丙烯酰胺10g，定容至1L。7%PAGE胶：10×TBE50mL，30%PAGE胶233.3mL，定容至1L。25%过硫酸铵溶液：0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。TE（0×108g550.5oLDA溶液37L1L。TE（.：0TE0L1L。染色液：1g硝酸银，定容至1L。1L15g5mL（。银染溶液的配制使用符合GB/T6682中4.3规定的三级水，试验过程使用符合分析纯的试剂和GB/T6682中4.3规定的一级水。送检样品宜为一年生针叶，-80℃超低温冷冻保存。同一红松无性系样品数量应大于5个。DNA使用CTAB提取法，或适合SSR指纹技术的商业试剂盒进行DNA提取。琼脂糖凝胶（1%）电泳检测DNA质量并进行浓度测定，稀释至20ng/μL充分溶解后备用。PCR引物信息包括核心引物信息和补充引物信息。选择使用核心引物进行检测，核心引物信息见附录A.1。当检测出不同无性系差异位点数小于2时，选择使用补充引物进行检测，补充引物信息见附录A.2。PCR反应采用20μL体系。943min，19430s，51~6030s，7215s3572℃延伸7min，4℃保存。PCR将玻璃板擦洗干净，双蒸水擦洗2遍，95%乙醇擦洗2遍，干燥。待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，调平。在40mL7%PAGE胶中加入TEMED和25%过硫酸铵各60μL，迅速混匀后匀速灌胶，以防出现气泡，在上部插入梳子，使其聚合1h，凝胶规格为186mm×95mm×1mm。拔去梳子后，使用移液器吹吸点样孔，清除气泡和杂质，每一个加样孔点入1μL混合有加样缓冲液（终浓度为1×）的样品，180V恒电压电泳1h。电泳结束后分开两块玻璃板，取下凝胶。150bp300bp染色：凝胶置于染色液中水平摇动染色8min；漂洗：双蒸水快速漂洗15s;显影：凝胶置于染色液中水平摇动至带纹出现；漂洗：双蒸水漂洗1min。X/XX/YXY0/0。对送检样品进行分析时，直接进行无性系之间的对比，如果送检样品某个引物位点出现可见的异质性10DNADNA在各引物位点的基因型以及样品在各引物位点的等位变异，并统计其在各引物位点的各种基因型（或等位变异。2=1=0对于利用附录A.1中核心引物未能检测到≥2个差异位点的无性系，应选择附录A.2中补充引物进行鉴别。；。应建立技术档案，内容包括无性系来源、定植地点、无性系名称、检测日期、基因型数据、判定结果等。附录A引物信息表包括核心引物信息表，见表A.1，补充引物信息表，见表A.2。表A.1核心引物信息表位点名称引物序列预期片段大小/bp退火温度/℃参考无性系基因型ALBI_160F:TGTTATTGCTAACGGAGATGGR:TTTTCTATTGTAGACAGTGTCGTCTT21553渤海省67215/215EPD11F:GTGGATGCAATGAAGAAAAACATR:ACGAATTGCAAAACTGCATAACT138-14553渤海省10138/145鹤岗5138/138苇青1号028140/143EPD12F:CTAAAGGAAACTCGAAACCCTTGR:ATGTCGATGATGATGAGGATGAT140-14455小北湖007142/142苇青2号042140/144EPD32F:CCTGCTAAAATTCATCTACATCCCR:AAAGCGAGGAAAATTTGCAGTAT150-15655渤海省51150/150渤海省69150/156苇青2号042154/156EPD70F:AGGCTTTAGTTTTTCAAATCCCAR:AAGTTGTTTGCTCGACTGTTAGC140-14555小北湖024140/140小北湖007140/145P49F:GAGATGAGCGAATCTGGGR:TACAAGTTCCACCTACGG290-29452小北湖007290/294小北湖024294/294鹤岗29290/290P70F:CAACATCGCCAATGACTCR:CCTACCTACGCTCTGCTC296-30254渤海省71298/300渤海省73302/302渤海省92296/296渤海省93296/298P72F:TGGGTTACCACCTTTAGCR:CAATCAGAGTCTGGAGCA200-20852渤海省008200/202小北湖024202/208渤海省51208/208苇青5号074200/208P79F:CCACCGCCAAGTCCATTAR:GCTTTGTTAGCCGTCCAG200-20355渤海省69203/203渤海省71200/200苇青1号028200/203P82F:GGAAGATGAATCGCAAACCR:ACACCCGCCTGAAGAGCA284-29054小北湖007284/290小北湖024290/290苇青5号074287/290P90F:R:141-14756渤海省70145/145渤海省71145/147孟家岗090141/145表A.2补充引物信息表位点名称引物序列退火温度/℃P11F：TGAGAATGAGGCGAACTGR：GAAGGAAAGGTAAGGTGGA53P25F：AAAGTTCACATTGGCACATCR：TCAGTCCAGCGACAACAG55P44F：TTTCGGTTCTCAGGCTCTR：CCCTGGTGGTACAATGAC53P47F：GTTTCCGAGATTCCCAGACR：CAGTAGTAATATCCCGTTT51P60F：AAACGCAGAGTGGAGGAAR：AACTCGGAGCATTTGGTG52P62F：AGTGGTCTACGCTGGAGTR：AACATTTAGGTCTTGGAGG51P63F：GCAGCAGATCAGAGGGAGR：CAGCCAACAACTGGTCATAC56P67F：TGAACGCACAGGCAAGTTR：GCGAAGGCAATGGTGAAA52P74F：ACGCTACCGATTCTTACCR：GTGTTCGCCTACAACTCAT52P92F：ACTTTGCGTGAATCAGACCR：AAAGTAAGGCTGCTTGCATGA53P010F：AATAAAGGAACTTACAGAGCR：GAACTTAGAAATAGGGTAGAA50P019F：AGAGCGTAAAACAGTTCAGTCR：ATGTCACCATTCCACTTGTC54P021F：TAGCGAAGGAAAAGGAGGTTR：CCAATGATTGAAGATGGTGA50P035F：TGTGGGTTTTTAGCAAGTAGGCR：ATACGTGAGTGGTGCTCTAT50P038F：ATTGTGAAGGTTCCTGCTGR：AGGTTTATGGTTTGGTGCT50P040F：ATATGACCTTGGGACATCTTR：CTACGCTTGAGTTATTCTTG50P042F：ATGGGATTGTGGTATGGTGR：TGAATTGAAGCGCAGTTAT51P044F：TATGTGCTTAGTGGTGAGR：AAAGATTGAGGAGTTGAA50P050F：TTACATAATACCTCATCCGTR：TGTGAACTCCATAGATTTAGA50P053F：GCCGTTGGCTCTGGAAATGAR：ATTGCCCTAGTGGGGACCTT50P056F：TAGAAACATTCCCTAAAACAAGR：GAAACAAACACCGAAATAGTC50Q010F：GGTTGCAAAAGGAATTGATAR：TTACTTAGGTAGGCAGGGTG50Q030F：CTTCTATGATATTGGTTCCTR：AGATGGAGATAAACTGAAGG50Q033F：TCTTTGTCGATCACCCTTTCR：TTGATTGTTTGCACTAAATG57Q059F：CAGGTGCCTTGGAAGAGGTTR：GGTGGAGAAATACGGGAGTG54Q069F：GGAGAAAAGGATGGTGAAAGR：GAGATGCAAAGACAGGGTGC50Q083F：AAAAGGGAGATGAAAGGTCAR：GAAACATACTCGAAGGGAAA50Q092F：CATGTCTCAAAAGACGTGATR：GAAATAGTTGGAGCAAGTGT50Q103F：TGATTGTTTGCACTAAATTCR：ACCCTCCATCCATATCTATA50Q141F：CTCTTTGTCAATCCCTCCTCR：GATAGCCAGAGTGACAAGGG50附 录 (资性)数据统计样表样品ALBI160EPD11EPD12EPD32EPD70P49P70P72P79P82P901*/**/**/**/**/**/**/**/**/**/**/*2*/**/**/**/**/**/**/**/*