《甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程（征求意见稿）》

ICS65.020.20B15DB32甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程TechnicalregulationformoleculardetectionofAlternariabrassi（送审稿）江苏省市场监督管理局发布1本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本标准的某些内容可能涉及专利。本标准发布机构不应承担识别这些专利的责任。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院、江苏省农业技术推广总站。本标准主要起草人：余方伟、曾晓萍、李建斌、马金俊、王神云、张伟、于利。2甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程本文件规定了甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程中重组酶聚合酶扩增方法的原理、试剂和材料、仪器设备、试验步骤和结果判定。本文件适用于甘蓝类蔬菜叶片、花茎、角果等样品中芸薹生链格孢（Alternariabrassicicola）的室2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3甘蓝类蔬菜黑斑病菌基本信息中文学名：芸薹生链格孢英文学名：Alternariabrassicicola分类地位：半知菌亚门，丝孢目，暗色菌科，链格孢属。其菌落形态和孢子特征见附录A。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）RPA重组酶聚合酶扩增（Recombinasepolymeraseamplification）ATP三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate）5原理重组酶聚合酶扩增是一种快速分子检测技术，主要依靠重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶在特定恒温条件下实现短时间内对靶标序列的高效扩增。RPA反应开始时，重组酶在ATP的参与下结3合引物，形成重组酶-引物复合体。这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA，然后侵入5'端位点，随后单链结合蛋白与被置换单链结合使其稳定。最后链置换DNA聚合酶结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸。以上步骤循环进行，实现DNA数量的指数增长。6试剂和材料除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的规定。6.1.1RPA所用的引物序列见表1。表1引物序列扩增片段大小AbF1AbR1CAGACATGAACACGCCAACATGACTAGACCGTGAGGCTTAGCGTAGAGTGTCAACGGTTC213bp6.1.2基因组DNA提取试剂盒。6.1.3RPA试剂盒。6.1.4DNA抽提液：Tris饱和酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1混合。6.1.550×TAE缓冲液。6.1.6琼脂糖。6.1.7核酸染料。6.1.8DL2000DNAMarker。7仪器设备7.1电子天平，感量0.01g。7.2台式低温高速离心机。7.3微量移液器：最大量程分别为2.5μL、10μL、20μL、100μL和1000μL。7.4PCR仪。7.54℃冰箱和-20℃冰箱。7.6水平电泳仪。7.7凝胶成像仪。8试验步骤8.1样品采集参照附录A信息，采集疑似黑斑病的病样，病样可暂时保存于4℃冰箱，但不宜超过48h。48.2样品处理取约100mg待检测样品置于液氮中充分研磨，使用基因组DNA提取试剂盒（CW0531M，江苏康为世纪生物科技股份有限公司）提取基因组DNA，保存于-20℃冰箱备用。8.3RPA反应以提取的疑似病株样品组织DNA溶液为模板，采用DNA恒温快速扩增试剂盒（WLB8201KIT，潍坊安普未来生物科技有限公司）进行RPA反应。同时设置以下对照：阳性对照为添加芸薹生链格孢基因组DNA溶液作为模板；阴性对照为添加健康甘蓝类蔬菜叶片来源的基因组DNA溶液作为模板；空白对照为添加无菌水作为模板。检测体系见表2。表2芸薹生链格孢的RPA反应体系组分体积(μL）Abuffer29.4AbF1（10μM）2AbR1（10μM）2DNA模板2ddH20Bbuffer2.5总体积50依次向反应管中加入上述组分，充分混匀后置于PCR仪中，设置反应条件为38℃,30min。反应结束后加入等体积DNA抽提液，4℃条件下以13200r/min离心5min，转移上清至新的离心管中。配制1×TAE缓冲液和1%琼脂糖凝胶（每50mL琼脂糖溶液中加入5μL10000×核酸染料用微量移液器各吸取5μLDL2000DNAMarker和10μL上清点样，进行琼脂糖凝胶电泳检测。9结果判定9.1试验成立条件阳性对照出现目的条带，阴性对照和空白对照无目的条带，试验成立（参考附录B）；如阳性对照、阴性对照和空白对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效。9.2试验结果判定被检样品出现大小为213bp的条带，判为检出黑斑病菌，否则判为未检出黑斑病菌。5A.1病菌生物学特性芸薹生链格孢的菌落呈青褐色，气生菌丝少，易产生孢子。分生孢子梗单生或簇生，常见直立生长，少见屈膝状弯曲。分生孢子常串生，倒棍棒状，淡褐色至深褐色，具横膈膜3~7个，纵、斜隔膜较少，仅0~3个，喙不发达，为单细胞短喙，孢子大小18~130μm×8~20μm。图1芸薹生链格孢菌落和孢子形态A.2黑斑病症状甘蓝类蔬菜的叶片、花茎和角果均可发病。该病多发生在外叶上，发病初期在叶面上产生黑色小斑点，直径3~7mm，同心轮纹不显著。温度高时，病斑迅速扩大为灰褐色圆形病斑，直径5～30m