45 猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备

PAGEPAGE29序号：编码：第十届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书作品名称：猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备学校全称：华南农业大学申报者姓名（集体名称）：张雨微类别：□√自然科学类学术论文 □哲学社会科学类社会调查报告和学术论文□科技发明制作A类□科技发明制作B类说明1．申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2．申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3．表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4．序号、编码由第十届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5．学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上（文章版面尺寸14.5×22cm），附于申报书后，论文不超8000字，调查报告不超15000字。6．作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7．其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A1．申报者情况（个人项目）说明：1．必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写个人作品的第一作者（承担申报作品60%以上的工作者）；2．本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。姓名张雨微性别女出生年月1988年5月申报者情况学校全称华南农业大学专业动物生物技术现学历本科年级三学制四年入学时间2006年9月作品全称猪生长抑素(SS)RNAi效应的假型慢病毒制备毕业论文题目通讯地址华南农业大学华山学生宿舍23栋505邮政编码510640单位电话常住地通讯地址华南农业大学华山学生宿舍23栋505邮政编码510640住宅电作者情况姓名性别年龄学历所在单位叶康男21本科华南农业大学资格认定学校学籍管理部门意见是否为2009□√是□否若是，其学号为：200630380131（部门盖章）2009年4月13日院系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果□√是□否负责人签名：2009年4月13日

B1．申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1．必须由申报者本人填写；2．本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3．作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4．硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备作品分类（D）A．机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等）C．数理（包括数学、物理、地球与空间科学等）D．生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健康、卫生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路SS于1972年首次发现能抑制GH的分泌，目前在生产上采取降低SS水平，解除SS对GH、IGF－I等的抑制，达到促进动物生长的目的。随着胚胎技术和转基因技术的发展，在动物整体水平上敲除或沉默目的基因或导入外源基因改良动物的生产性能已得到了广泛的研究与应用。一种比较好的研究思路和策略就是在整体水平上敲除或沉默SS基因或降低表达水平可长久性、可遗传性获得低SS水平的转基因动物。本实验在已有研究的基础上，拟选择在动物生长调控中起重要作用的负调节因子-生长抑素（SS）作为靶基因，制备最优RNAi效应的假型慢病毒，以便从遗传角度有效获得促生长的优良转基因动物，并为研究动物生长调控提供有益的动物模型。作品的科学性、先进性及独特之处（1）在方法上创新性为动物整体水平上缄默SS基因表达提供优良RNAi效应的shRNA序列；（2）在思路上前沿性提出利用慢病毒载体与RNAi技术相结合廉价，为快速生产SS基因部分缄默的转基因动物模型奠定一定的实验基础。作品的实际应用价值和现实意义本实验选择在动物生长调控中起重要作用的负调节因子-生长抑素（SS）作为靶基因，制备最优RNAi效应的假型慢病毒，以便从遗传角度有效获得促生长的优良转基因动物，为畜牧业动物育种改良可提供良好的经济利益和社会效益，也为这项技术早日进入实际应用打下基础，并可为研究动物生长调控提供有益的动物模型。学术论文文摘生长抑素SS是动物生长激素GH释放的负性因子，其在血液中浓度下降（如免疫中和）能间接促进动物生长、提高动物的生产性能。下调SS基因的表达成了改良动物生长性能的方法。我们用基因转染技术在动物体内表达SS-HBsAg融合蛋白产生中和抗体得到促生长效果。RNAi缄默靶基因的表达在多种生物体内获得成功应用。shRNA是模仿体内miRNA的结构而构建的能在细胞内表达的短发夹RNA，引起特异的RNAi效应。慢病毒载体能感染分裂细胞也能感染静止细胞，有很强的感染和整合能力，是目前应用前景广泛的一种基因转移载体。本研究在以往工作基础上，结合RNAi和慢病毒载体技术，设计和筛选产生SS靶基因RNAi效应的shRNA表达序列，以便通过慢病毒载体的介导下整合到动物胚胎细胞染色体上，生产出携带SS-shRNA的转基因动物。通过RNAi效应在动物整体水平上缄默SS的表达，从遗传改造的角度达到提高动物生长性能的目的。为提高畜牧业动物生产性能打下理论和实践的基础，同时为动物生长调节的研究建立良好动物模型。作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励2008年中国畜牧兽医学会动物生理生化学分会（西安.杨凌）《畜牧与兽医》增刊：《慢病毒载体介导的RNA干扰生长抑素表达下调及转基因动物模型的建立》；2009年“挑战杯”华南农业大学大学生课外学术科技作品竞赛二等奖。鉴定结果无请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录SS基因RNAi干涉效果的筛选慢病毒载体的制备DieckhoffB,PetersenB,KuesWA.,KurthR,NiemannH,DennerJ.Knockdownofporcineendogenousretrovirus(PERV)expressionbyPERV-specificshRNAintransgenicpigs.Xenotransplantation.2008;15:36-45.白莉，杨忠亮，李荣田．2008．用于RNA干涉的siRNA的设计与合成．黑龙江科技信息．06：2申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）《猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备》动物的生产性能是畜牧业发展过程中的重要经济性状，生长抑素(SSI)是抑制动物生长的主要因素。SST主动免疫和添加SST抑制剂虽然取得了一定的效果但是仍不理想，而传统的育种方法在改善动物的生长性能方面进程非常缓慢，因而探索探索新的方法和技术十分必要。RNAi是下调靶基因的有效方法，慢病毒载体也是目前应用前景最广泛的基因转移载体，本试验根据靶基因SST设计和筛选出了最优RNAi效应的靶基因-shRNA序列，并已成功构建到慢病毒载体上，通过慢病毒载体和精原干细胞介导联合制备出稳定表达靶基因-shRNA的可遗传的转基因动物，利用RNAi效应在动物整体水平上下调SST的表达，从而到达提高动物生产性能的目的。科研管理部门签章年月日C.当前国内外同类课题研究水平概述说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写；2.填写此栏有助于评审。（1）生长抑素对生长激素分泌的负调控：生长激素（growthhormone,GH）是调节动物和人生长的主要激素，由垂体分泌，主要受下丘脑分泌的正性调控因子即生长激素释放因子（growthhormonereleasingfactor,GRF）或称生长激素释放激素（growthhormonereleasinghormone,GHRH）和负性调控因子即生长激素释放抑制激素（somatostatin,SS）或简称生长抑素的双向调节。研究表明SS能抑制脑垂体细胞的cAMP生成，提高cGMP浓度，抑制GH的合成与释放，降低血液GH浓度。同时SS还能调节GRF的释放，影响GRF基因的表达，通过拮抗GRF的作用以协同控制GH的水平。（2）生长抑素在动物促生长领域的应用：GH的水平影响骨、软骨的生长以及肌蛋白的合成与沉积等，从而影响动物和人的生长状况。在生产应用上GH具有促生长，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高饲料转化率等方面的作用，有着广泛的经济价值和社会效益。生长抑素（SS）通过抑制垂体分泌GH，从而降低GH水平。目前在生产上采取降低SS水平，解除SS对GH、IGF－I等的抑制，达到促进动物生长的目的，如主动免疫技术。随着胚胎技术和转基因技术的发展，在动物整体水平上敲除或沉默目的基因或导入外源基因改良动物的生产性能已得到了广泛的研究与应用。一种比较好的研究思路和策略就是在整体水平上敲除或沉默SS基因或降低表达水平可长久性、可遗传性获得低SS水平的转基因动物。（3）RNAi技术制备转基因动物：RNAi（RNAinterference）称为RNA干涉，通过双链RNA（dsRNA）诱导与之同源的mRNA降解，导致目标基因转录后缄默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）的现象或机制。在动物机体中，有两种小分子RNA能介导这种现象的发生，microRNA(miRNA)和siRNA。前者形成分子内双链RNA，后者形成分子间双链RNA，两者双链RNA在细胞质内经Dicer酶切割成长度约为21~25个nt片段，即小分子双链RNA。在解旋酶(helicase)的作用下解开双链RNA，其中仅保留一条RNA链与RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)结合，根据碱基互补配对原则识别靶mRNA，引起靶mRNA被剪切降解或翻译的抑制。2002年，Hasuwa等人成功地建立了第一例应用RNAi的转基因小鼠。几乎同时多数研究者们利用RNA聚合酶III的启动子构建shRNA的载体应用于转染哺乳动物的细胞系，结果对靶基因均产生了稳定的转录后缄默效果，表达下降90%以上。2006年Dann等人通过慢病毒介导RNAi敲除了大鼠上的Dazal基因，构建了两条shRNA序列（pLLU2G-Dazl1和pLLU2G-Dazl2），结果这两条转基因序列对靶基因Dazal的表达均产生了几乎完全的抑制，并在后代中获得了稳定的可遗传的Dazl-shRNA转基因大鼠。shRNA转基因小鼠或大鼠的出现使得RNAi技术在哺乳动物整体水平上进行靶基因的敲低或缄默成为可能。研究表明与建立在胚胎干细胞和同源重组技术上的基因敲除相比，用RNAi技术建立转基因动物无论是时间上还是在效率上都有着很大的优势。（4）慢病毒载体的特点与构建：慢病毒（lentivirus）是一种逆转录病毒，引起慢性感染得名。与其他逆转录病毒相比不仅感染分裂细胞、也感染非分裂细胞，即静止细胞如神经细胞、巨嗜细胞、造血干细胞和肌肉细胞等，大大提高了感染效率，感染之后能高效整合和表达目的基因。用慢病毒载体感染动物卵母细胞和胚胎细胞能有效构建转基因动物。Hofmann等用含GFP目的基因的慢病毒载体转染猪胚胎，产下46只小猪中，有32只携带GFP基因，其中30只能表达GFP。同时用该载体转染牛的卵母细胞时也获得了GFP高表达率。慢病毒载体（lentiviralvector,LV）的构建原理是将HIV-1基因组中的顺式作用元件（如包装信号和长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序列分离。载体系统分成包装部分和载体部分，其中包装部分由去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列构成，仅提供病毒包装所需蛋白；载体部分与包装部分互补，含包装、逆转录和整合所需顺式作用序列。（5）慢病毒载体制备转基因动物的应用：慢病毒载体（LV）于1996年发展以来只是用于细胞转染和基因治疗的研究，但直到2002年Lois等将其用于转基因大鼠和小鼠的制备，之后LV在制备转基因动物上获得极大的发展与应用。与显微注射法相比，免去了操作困难、效率低下和成本过高的缺点。LV法相对操作简单、整合能力强，通过感染早期胚胎或受精卵细胞即可获得转基因胚胎。由于LV的高效率感染和在宿主细胞DNA上的高度整合特性，可以大大提高外源基因的转移效率。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1．由推荐者本人填写；2．推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组集体推荐亦可）；3．推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4．推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓名张永亮性别男年龄46职称教授/博导工作单位华南农业大学动物科学学院通讯地址广州市天河区五山邮政编码510642单位电宅电话推荐者所在单位签章张永亮老师是华南农业大学动物科学学院院长，动物营养系教授、博士生导师。全国动物生理生化分会副理事长、农业生化与分子生物学分会理事、吉林省生化与分子生物学理事、全军专业生化委员会委员，《中国兽医学报》编委。（签章）2009年4月13日请对申报者申报情况的真实性作出阐述申报内容真实可信，已有一定的实验基础。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价该作品具备较好的前期基础，具有一定得科学研究价值。研究手段较先进，技术路线明确，实验条件具备。所获慢病毒是一种广泛应用的基因转移载体，所获转基因动物具有较好的示范和推广前景。值得进一步推广和应用。其它说明推荐者情况姓名张守全性别男年龄45职称教授/博导工作单位华南农业大学动物科学学院通讯地址广州市五山路483号邮政编码510642单位电宅电话推荐者所在单位签章张守全老师是华南农业大学动物科学学院副院长，动物遗传育种与繁殖系教授、博士生导师，广东省高等学校“千百十工程”校级培养对象。目前兼职广东省人体组织工程学会常务理事；广东省养猪行业协会顾问等。（签章）2009年4月13日请对申报者申报情况的真实性作出阐述该研究结果由张雨微、叶康两位同学在导师的指导下完成的。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价该作品以生长抑素（SS）作为靶基因，制备优化了RNAi效应的假型慢病毒，以期获得促生长的转基因动物，为畜牧业动物育种改良可提供良好的经济利益和社会效益，并可为研究动物生长调控提供有益的动物模型。该研究成果通过中试后，可在畜牧生产应用，应用前景较广。其它说明学校组织协调机构确认并盖章（团委代章）2009年4月13日校主管领导或校主管部门确认盖章2009年4月13日E．大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见审查人（签名）年月日组委会秘书处形式审查意见审查人（签名）年月日组委会秘书处审查结果□合格□不合格负责人（签名）年月日猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备作者：张雨微叶康指导老师：张永亮教授习欠云讲师作者单位：华南农业大学动物科学学院，广州，510640【摘要】生长抑素(SST)是抑制动物生长的主要因子。SST主动免疫和添加SST抑制剂对提高动物生长取得了一定的效果但仍不理想，而传统的育种方法在改善动物的生长性能方面进程非常缓慢，因而探索探索新的方法和技术十分必要。RNAi是下调靶基因的有效方法，慢病毒载体也是目前应用前景最广泛的基因转移载体。本研究根据靶基因SST设计和筛选出了最优RNAi效应的靶基因-shRNA序列，通过RIA检测转染细胞裂解液中SS浓度，结果表明SS-shRNA产生的siRNA对SST基因表达抑制率为86.3-87.9%。并已成功将SS-shRNA序列构建到慢病毒载体上，利用慢病毒四质粒系统成功包装出假病毒颗粒，经测定病毒原液的滴度达到5×104ifu/ml，超速离心后病毒滴度为5×109ifu/ml，该病毒滴度完全满足慢病毒介导转基因动物的制备的需要。本研究为下一步慢病毒载体与动物生殖细胞联合介导制备靶基因-shRNA表达的转基因动物，通过RNAi效应在动物整体水平上下调SST的表达，提高动物生产性能提供了前期实验基础。【关键词】生长抑素RNAi效应假型慢病毒【正文】1引言1.1生长抑素在动物促生长领域的应用动物生长的过程受很多激素调节，其中生长激素（GH，GrowthHormone）是调节动物生长的核心之一。GH的水平影响骨、软骨的生长以及肌蛋白的合成与沉积等，从而影响动物和人的生长状况。在生产应用上GH具有促生长，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高饲料转化率等方面的作用，有着广泛的经济价值和社会效益。生长抑素（SS）通过抑制垂体分泌GH，从而降低GH水平。目前在生产上采取降低SS水平，解除SS对GH、IGF－I等的抑制，达到促进动物生长的目的，如主动免疫技术。随着胚胎技术和转基因技术的发展，在动物整体水平上敲除或沉默目的基因或导入外源基因改良动物的生产性能已得到了广泛的研究与应用。一种比较好的研究思路和策略就是在整体水平上敲除或沉默SS基因或降低表达水平可长久性、可遗传性获得低SS水平的转基因动物。1.2慢病毒载体与RNAi技术联合介导转基因动物目前制约转基因动物产业化的瓶颈问题主要表现在转基因成本高、效率低、外源基因表达量不高以及遗传性状不稳定等方面。在已建立的转基因方法中，比较成熟的有显微注射法和体细胞克隆法，目前多种转基因动物是通过这两种方法获得的。DNA显微注射法是最早出现的一种转基因方法，该方法需要严格的显微操作技术，制作成本高（6-30万美元）、效率低（<1%）等特点，比较难以大众化推广应用。体细胞核移植法是目前认为效率较高、应用广泛的一种转基因方法。该法在连续的胚胎克隆会积累后成遗传的错误，降低了克隆的效率。因此通过克隆方法增加个体后代比较困难。虽然该法转基因率100%，但由于克隆胚胎的制备成功率为0.05-1.2%，因而整个转基因效率跟显微注射法差不多。此外，胚胎干细胞法目前在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚，还不成熟。其他几种方法相对操作简单、成本低，但还没有成熟。如逆转录病毒载体介导法、精子介导基因转移法以及睾丸介导基因转移法等均存在外源基因整合效率差的问题。寻找和探索高效、经济、便捷的转基因的新技术和新方法有着重要的意义和紧迫性。慢病毒（lentivirus，LV）载体法是近年来发展起来的一种有效的基因转移载体。由于其高整合和高表达效应、低成本和操作简单等优点有望成为一种应用广泛的新型基因转移载体。目前利用慢病毒载体在许多动物上获得了成功，如小鼠、大鼠、牛、猪、羊等。与其它逆转录病毒载体法相比，慢病毒不仅可以感染静止细胞，还能感染分裂细胞，极大地提高了感染力；同时研究表明将慢病毒载体LTRs内增强子和启动子用通用或组织特异性启动子取代，转基因猪生产效率可达到31%，表达效率达90%以上，表明除了高的感染力、很高的整合效率和表达效率，同时成本大约是显微注射法的十分之一。很有希望发展成为简捷、高效、低成本的转基因技术。但是目前慢病毒载体介导的基因转移方法在安全性、甲基化沉默和定点整合方面还有待于进一步改进。若将慢病毒载体与上述转基因技术联合应用对寻找和探索高效、经济、便捷的转基因的新技术和新方法有着重要的意义。过去转基因的目的主要通过两种途径，一是直接转入外源基因过量表达，如生物反应器；二是同源重组敲除（knock-out）靶基因，如疾病动物模型和器官移植，但完全敲除某个功能基因，在有些情况下可能会引发了一系列新的机能紊乱。将目标基因的功能只是部分调控（knockdown），在改变动物的某些重要性状方面将会有重要的作用。近年来一系列研究表明，动物的生长发育是由一系列复杂、多层次的基因表达网络所调控。与基因敲除相比，将靶基因的功能只是部分下调，既可以维持动物生长发育调控网络整体性，又可以改变动物的某些重要性状，所以该项技术在转基因动物育种方面将会有重要的作用。RNA干涉（RNAinterference，RNAi）技术是近年来发展起来的一种新型转基因打靶技术,是目前部分调控目的基因表达的有效方法。RNAi技术是建立在非编码小分子RNA如miRNA(microRNA)和siRNA（smallinterferingRNA）对基因表达特异性调节的基础上。这种调节活动通过下调目的基因的表达，影响动物的各种发育和生理过程，如细胞分化、组织和器官发育、内分泌、新陈代谢、免疫应答以及疾病的发生等。短发夹RNA(ShorthairpinRNA，shRNA)是一种人工设计的RNA分子，可以在细胞内加工成siRNA来发挥作用。可以通过构建载体来表达目的基因的RNA干涉分子，并通过siRNA和miRNA途径下调目的基因的表达。目前通过慢病毒载体和RNA干涉技术联合介导转基因动物的生产已经在大鼠、小鼠、羊，尤其在猪上有成功的报道。1.3本研究的思路本研究选择在动物生长调控中起重要作用的负调节因子-生长抑素（SS）作为靶基因，制备最优RNAi效应的假型慢病毒，以便从遗传角度有效获得促生长的优良转基因动物，为畜牧业动物育种改良可提供良好的经济利益和社会效益，也为这项技术早日进入实际应用打下基础，并可为研究动物生长调控提供有益的动物模型。在方法上创新性为动物整体水平上缄默SS基因表达提供优良RNAi效应的shRNA序列；在思路上前沿性提出利用慢病毒载体与RNAi技术相结合廉价，为快速生产SS基因部分缄默的转基因动物模型奠定一定的实验基础。2实验材料主要质粒与试剂：限制性内切酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶DNAMarker、dNTPs以及RibonucleaseInhibitor等均购自大连TaKaRa公司。大肠杆菌DH5α、pcDNA3.1(-)质粒均由本室保存；NIH3T3细胞株为本室保存。pshRNA-copGFPLentivector穿梭质粒、慢病毒包装系统pPACKLentivectorPackagingSystem，该系统为四质粒共转染法即一个穿梭质粒，三个包装质粒pPackA(pREV)、pPackB(pVsv-g)及pPackC(pGag-pol)从上海倍尼菲生物科技有限公司购得。3实验方法3.1生长抑素（SS）基因siRNA的设计根据GenBank上的猪的SS基因mRNA的序列（序列号：NM_001009583）设计SS的siRNA。设计原则为：从起始密码AUG下游50～100nt开始，避开5’端或3’端的UTRs，搜索AA（N19）序列；有义链1位为G或C，19位为A或U，双链5’端能量应该比3’端高，即有义链15～19至少有3个A或U，或者13～19至少有5个A或U；siRNA5’端必须磷酸化，3’端悬垂两个dTdT，或是UU；选择GC含量在30%～50%的siRNA，亦有报道GC含量不宜超过36.8%；16位最好为C，13位最好为非G；避免超过三个G或三个C重叠，多聚G或多聚C序列能产生堆积形成类聚物而干扰沉默机制；使用BLAST(/BLAST/)将潜在的靶序列和相应的猪的基因组数据库进行比较，排除那些和其它基因明显同源的靶序列；由于RNApolⅢ启动子的转录终止信号是连续的6个“T”的多聚核苷酸，因此，应避免在靶序列中存在≥4个“T”靶序列1（siRNA1）：5’-AAGACTTTCACATCCTGTTAG靶序列2（siRNA2）：5’-AAGAATTTCTTCTGGAAGACT-33.2发夹SS-siRNA转录模板寡核苷酸的设计与合成按照pshRNA-copGFPLentivector的说明进行设计与合成，图1是如何将siRNA靶序列转换成为转录模板寡核苷酸序列的程序示意图。两个反向互补排列的19nt特异性靶序列由一个12nt（5’-CTTCCTGTCAGA-3’）的loop相连接，形成茎环的发夹结构。转录模板两端分别为BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，并以5个T作为RNApolⅢ的转录终止子。分别合成发夹siRNA转录模板的两条相应的图1发夹siRNA转录模板的设计shRNA-DNA合成片段信息：siRNA1-f：5’-GATCCGACTTTCACATCCTGTTAGTTCAAGAGACTAACAGGATGTGAAAGTCTTTTTTG-3siRNA1-r：5’-AATTCAAAAAAGACTTTCACATCCTGTTAGTCTCTTGAACTAACAGGATGTGAAAGTCG-3siRNA2-f：5’-GATCCGAATTTCTTCTGGAAGACTAGAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTTTTTG-3siRNA2-r：5’-AATTCAAAAAATCTCTTGAAAGTCTTCCAGAAGAAATTCG-3’同时模板链两端分别设计酶切位点为BamHⅠ和EcoRⅠ，由上海吉凯基因技术有限公司合成。3.3SS-siRNA表达载体的构建及鉴定图2为pshRNA-copGFPLentivector载体图，此载体带有H1RNApolⅢ启动子（3761bp～3977bp）及哺乳动物荧光筛选标记copGFP（2279bp～3037bp）。图2pshRNA-copGFPLentivector载体图1.退火，溶解转录模板DNA，稀释至浓度为1μg/μL，准备退火溶液。单链各1μg混合于10×退火溶液中，90℃1~3min,37℃1h，得到转录模板双链DNA插入片段，浓度为10ng/μL，2.载体pshRNA-copGFP质粒通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，37℃酶切过夜。1%琼脂糖凝胶电泳，博大泰克凝胶片断回收纯化试剂盒回收载体片段。3.将shRNA-DNA退火产物与双切pshRNA-copGFPLentivector 载体连接，16℃水浴连接，反应过夜。4.转化。取连接反应产物（设阴性对照质粒）加入到适量E.coli(DH5α)感受态细胞中，CaCl2法转化。Amp(50μg/mL)筛选。5.阳性菌落的PCR扩增。挑取样品阳性单菌落，使用多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落。其中Fprimer：5’-AATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’、Rprimer：5’-TGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTA-3’。PCR反应条件如下：94℃10分钟，94℃30秒,55℃30秒，72℃30秒。反应进行33个循环，产物在6.使用PCR产物5μL上样，1%琼脂糖凝胶电泳检测；7.若电泳片段大小正确，则挑取阳性菌落于3mLLB液体培养基中，37℃8.提取质粒，使用载体上的引物（F/Rprimer）将质粒DNA送测序，比对测试结果与设计DNA的序列是否一致。图3pcDNA3.1(+/-)载体图Fig.3pcDNA3.1(+/-)VectorMap3.4真核表达载体pcDNA3.1-SST图3pcDNA3.1(+/-)载体图Fig.3pcDNA3.1(+/-)VectorMap1、SST-cDNA的扩增根据SST基因序列设计引物，扩增SST包含编码区和3’上游引物：5’-GGAATTCATGCTGTCCTGCCGCCTEcoRI下游引物：5’-CCCAAGCTTCTAACAGGATGTGAAAGHindIII以猪的下丘脑提取RNA反转录产物为模板，引物为SST的上下游引物，扩增的目的片段为351bp。PCR反应采用50µL反应体系。体系的组成为：10×PCR缓冲液5µL，2.6mmol/LdNTP4µL，上游引物（10pmol/µL）1µL，下游引物（10pmol/µL）1µL，模板2µL，TaqDNA聚合酶（5U/µL）0.3µL，补加ddH2O至50µL。按以下条件进行PCR反应：94℃，2min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，3min，共35个循环，然后2、目的基因SSTPCR产物的纯化将剩余的PCR产物，用试剂盒纯化PCR产物，具体操作按试剂盒说明进行。3、SST克隆到pMD18-T载体将上述纯化的片段作为插入片段，连接到pMD18-T载体上。连接反应体系：PCR产物6µL，2×LigationBuffer7.5µL，T4DNALigase1µL，pMD18-TVector0.5µL，总体积15.0μL。室温作用1h。连接产物命名为T-SST。将连接产物转化DH5α感受态菌，然后进行重组质粒的提取与鉴定。利用生物分析软件DNAMAN进行同源性分析。4、pcDNA3.1-SST载体构建EcoRI与HindⅢ双酶切pcDNA3.1(-)，1%琼脂糖凝胶电泳后回收载体大片段5kb左右片段。酶切T-SST，回收SST片段，然后进行SST目的片段与pcDNA3.1(-)大片段的连接与转化。用试剂盒提取重组质粒，进行酶切鉴定并测序，条件同前。3.5RNA干扰有效靶点的筛选1、三种表达质粒转染真核细胞将pcDNA3.1-SS分别和LV-siRNA1、LV-siRNA2共转染入NIH3T3细胞进行表达。设pcDNA3.1-SS单独转染和空细胞对照，每个处理设3个重复。其中pcDNA3.1-SS与慢病毒干扰质粒的比例为1：6。脂质体转染，按照LipofectamineTM2000试剂说明书进行。转染后48h，部分细胞用Trizol收集（一般用6孔培养板），-7048h收集转染细胞并计数，细胞用0.25%的胰酶消化细胞，离心1000r/min，5min，沉淀加入200μL细胞裂解液剧烈震荡，裂解细胞，离心1000r/min，5min，上清-702、RIA检测参照试剂盒说明书，采用RIA方法测定，检测转染细胞裂解液中SST的浓度。操作步骤详见说明书。3、数据处理数据采用SAS9.0软件进行统计分析，数值用平均值±标准误(mean±S.E.)表示。对同一品种的数值进行单因素方差分析(one-wayANOVA)，并进行邓肯氏多重比较(Duncan’smultiplerangetest)；P<0.05为差异显著。3.6病毒包装293T细胞的培养1、细胞的冻存取生长旺盛的细胞并铺满培养瓶的90%，用0.05%胰酶消化至细胞变圆、即将漂浮时，加至少10倍体积的含有10%的FBS的培养液中止反应，800r/min离心5min，无菌吸管吸弃液体，加入完全培养基制成细胞悬液(细胞浓度应=1×106细胞/mL)，加入终浓度为10%的DMSO，用冻存管分装，4℃1h，-20℃2h，-702、细胞的复苏从液氮罐中取出细胞冻存管，应带防护手套。迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至离心管中，加入10mLD-MEM洗涤，800r/min离心5min，弃上清。将沉淀用含10％胎牛血清的D-MEM悬浮后转移至培养瓶中，37℃、5%CO3、细胞的传代(1)待贴壁细胞长满单层，吸弃培养基，加入灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。(2)加入0.25%胰酶进行消化，待倒置显微镜下观察细胞已收缩变圆时，加入含10%胎牛血清的D-MEM终止反应，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，并将其分装于2个培养瓶中，即完成1次传代。4、高纯度无内毒素质粒制备使用EndoFree™PlasmidMaxiKit制备无内毒素LV-siRNA1及三个包装质粒pPackA、pPackB及pPackC，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之间。5、高纯度无内毒素质粒制备使用EndoFree™PlasmidMaxiKit制备无内毒素LV-siRNA1及三个包装质粒pPackA、pPackB及pPackC，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之间。6、质粒的定量将各次大量制备的质粒DNA在GeneQuant上进行定量。具体方法是：将质粒进行100、200、400倍比稀释，用ddH2O作空白对照，分别测定三次取平均值，读取样品的dsDNA浓度，然后计算出dsDNA的量。7、慢病毒的包装（1）细胞的转染：A.转染前2-3天，用含有灭活的血清和抗生素的D-MEM培养基培养293T细胞株。转染前一天，在新的10cm的培养皿中接种5×106293T细胞，完全吹散细胞以保证细胞均匀的分布。当转染时细胞最好铺满培养皿的50-70％。B.将2μg（体积最好在2-25μL之间）带有目的基因的慢病毒表达载体同20μL（10μg）pPACK包装质粒混合物混合，用400μL不含血清和抗生素的D-MEM培养基稀释质粒，混匀，室温孵育15分钟。C.用400μL不含血清和抗生素的D-MEM培养基稀释30μLLipofectamine2000TM试剂，轻微混匀。D.将稀释的Lipofectamine2000TM试剂逐滴加入到DNA/D-MEM混合液中，轻轻地上下颠倒混匀，室温孵育15分钟。E.在第4步孵育形成转染混合物的同时，用10mL不含血清和抗生素的D-MEM洗293T细胞一次，然后加入9mL含2％血清不含抗生素的D-MEM培养基。F.将第4步中产生的DNA/Lipofectamine2000TM试剂混合物加入第5步中处理的培养皿中，轻轻地将混合物和培养基混匀，CO2培养箱中37℃G.用新鲜的含2％血清和抗生素的D-MEM培养基替换掉含有转染混合物的培养基，CO2培养箱中继续培养48小时。注意：观察培养基的颜色。培养24小时后和48小时后，如果由于293T细胞很高的代谢活性引起培养基颜色变黄（呈酸性）的话，则分别收集这两个时间点的上清。通常产生病毒的高峰出现在48小时。用含2％血清不含抗生素的D-MEM培养基替换掉上清液。（2）病毒的收获：收集转染后48小时的293T细胞上清液。于4℃，4000rpm/min离心10分钟，除去细胞碎片。然后将上清液用0.45μm的PVDF滤膜过滤（低蛋白结合能力的滤膜）。病毒液可以直接-804实验结果4.1靶向SSmRNA的siRNA序列设计借助互联网上IrisGenetics的软件程序siRNADNADesigner1.3设计靶向SSmRNA（序列号：NM_001009583）的siRNA序列，依据Tuschl等关于siRNA的设计原则，将设计出的序列利用BLAST和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其它基因明显同源的靶序列。最终选择以下序列作为siRNA靶序列，记作S（GC含量为33.3%）。316bp:AAGAATTTCTTCTGGAAGACT4.2SS-siRNA转录模板寡核苷酸的设计及合成将siRNA设计成相应的表达发夹shRNA的DNA单链模板，两端分别为BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点，合成1对发夹shRNA转录模板的DNA单链，由上海倍尼菲生物科技有限公司合成，序列如下：5'-GATCCGAATTTCTTCTGGAAGACTCTTCCTGTCAGAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTTTTG-3'3'-GCTTAAAGAAGACCTTCTGAGAAGGACAGTCTTCAGAAGGTCTTCTTTAAGAAAAACTTAA-3'4.3SS-siRNA转录模板表达重组质粒的构建及鉴定退火产物与线性LV-shRNA-GFP载体连接，转化，每个片段挑5个菌落，将PCR反应产物进行电泳检测。将电泳的结果与阴性对照（空载体）比较，目的条带与设计相符，挑选阳性克隆进行测序。LV-siRNA1干扰质粒PCR目的产物电泳结果如图4，LV-siRNA2干扰质粒PCR目的产物电泳结果如图5。123456123456M123456图4LV图4LV-siRNA1PCR鉴定1-2:阴性对照;3:H2O;4:空质粒对照;5-6:阳性克隆;M:DL2000Marker图5LV-siRNA2PCR鉴定1:H2O;2:空质粒对照;3、5-6:阴性对照;4:阳性克隆;M:DL2000Marker重组质粒菌液鉴定扩增出的基因片段大小与理论（156bp）相符。LV-siRNA1和LV-siRNA2测序结果与原设计的完全相同，没有基因突变。证明已成功构建了两个慢病毒干扰质粒。4.4真核表达载体pcDNA3.1-SST4.4.1SST基因达到获得M123提取猪下丘脑组织总RNA（图6），RT-PCR扩增得到SST前体cDNA，1%琼脂糖凝胶电泳在250bp-500bp处可见条带，与理论值相符（351bp）（图7）。M12328s28s18s图6猪下丘脑组织总RNA图7RT-PCR扩增SST图7RT-PCR扩增SSTM:DL2000Marker;1-3:SST目的基因4.4.2重组质粒pcDNA3.1-SST的构建与鉴定以下丘脑组织总RNA反转录产物为模板进行PCR扩增，获得SST基因片段并在两端添加了EcoRI和HindIII。胶回收下丘脑组织RT-PCR产物，方法详见说明书。SST基因片段回收产物连接pMD18-TVector，构建重组质粒T-SST，其酶切和PCR鉴定结果分别如图8。M134M2M134M2bM112a图8T-SSTPCR和酶切鉴定图8T-SSTPCR和酶切鉴定a:SSTPCR;b:SST酶切M1:DL2000Marker;M2:λ-EcoT14ⅠMarker;1-2:PCR产物;3-4:质粒双酶切由上图可以看出在250bp-500bp处有目的带出现，大小与理论（351bp）相符。DNAMAN软件分析测序结果表明，T-SST中插入DNA的序列与设计序列同源性为100％，说明获得了序列正确的SST基因片段。重组质粒pcDNA-SSPCR鉴定结果分别见图2-7，扩增出的基因片段大小与理论（351bp）相符，其双酶切鉴定结果见图2-8。通过PCR和酶切鉴定以及序列鉴定，证明已成功构建了pcDNA-SS真核表达载体。4.4.3RIA检测结果RIA检测细胞裂解液中SST含量结果见图9图9转染图9转染NIH3T3细胞裂解液中SST的浓度1:pcDNA3.1-SS与LV-siRNA1共转染;2:pcDNA3.1-SS与LV-siRNA1共转染;3:pcDNA3.1-SS单独转染;4:空白组由图1-9可知，阴性对照组即没转染质粒的细胞不表达SST。与第3组相比，第1和2组的SST浓度极显著降低即pcDNA3.1-SS与干扰质粒的比例为1：6(P<0.01)，第1组和第2组之间差异不显著(P>0.05)，但第1组SST浓度比第2组有所降低。综合以上确定LV-siRNA1慢病毒干扰质粒的干扰效果较好，用于后续的试验。4.5病毒的包装慢病毒的包装采用四质粒系统共转293T的方法，共转的质粒分别在293T中表达各种病毒蛋白，与含识别信号的转移载体结合装配后形成假病毒颗粒，胞吐到培养基。图10显示共转染293T转染效率。baba图图10慢病毒四质粒系统共转染293T(10×)a:荧光观察;b:白光观察慢病毒载体四质粒系统共转染293T细胞，在细胞内病毒蛋白装配成含转移载体的病毒，由图3.1可知荧光显微镜下观察到荧光的高表达，说明四质粒系统高效的转染了293T细胞，保证了病毒包装的效率。4.6慢病毒滴度的测定慢病毒不同稀释倍数感染293T后荧光的表达情况如图11，结合图并由公式计算出本试验包装的病毒滴度为5×104ifu/ml。超速离心后病毒滴度达到5×109ifu/mlcbacbafedfed图图11慢病毒滴度测定不同稀释倍数下细胞感染的状况(10×)a:病毒稀释倍数10e0;b:病毒稀释倍数10el;c:病毒稀释倍数10e2;d:病毒稀释倍数10e3;e:病毒稀释倍数10e4;f:空白细胞5讨论5.1靶基因siRNA的设计siRNA是一种基于核酸的靶向抑制基因表达的分子，具有特异性和靶向性的特点。对于大多数基因来说，细胞质内发生的靶向mRNA的抑制作用足以下调目的基因的表达。siRNA能够在低浓度的情况下实现基因沉默，效果比以有报道的反义寡核苷酸、核酶和脱氧核酶都好，因此，siRNA是最有效的反义分子。RNAi成功的关键是siRNA作用靶序列的设计选择，即如何从SS的mRNA序列中找到siRNA的最佳靶位点是必须首先考虑的问题。我们利用网站检索并排除了和其他基因明显同源的靶序列。siRNA的干涉效率直接关系到基因治疗的效果，目前关于siRNA干涉效率的研究主要集中在两个方面：一方面研究siRNA的特点，强调siRNA双链的热力学结构是高效沉默的先决条件；另一方面研究siRNA所识别的靶序列的特征，认为siRNA的抑制效果与其所识别靶序列的结构有关。RNAi虽然具有很强的基因沉默能力，但识别同一靶mRNA的不同序列的siRNA的干扰效果却不尽相同。得到高效的siRNA是利用RNAi基因功能和表达调控研究的基础。有研究指出，在哺乳动物细胞中，siRNA的干涉效果除了受自身的结构和功能特点影响外最终要的决定因素是其识别的靶mRNA的局部结构特征。也就是说，尽管siRNA序列是实现RNA干涉的基础，但其识别的靶序列局部复杂的结构直接影响siRNA的干涉效率。因此我们将全长315bp的SSmRNA序列进行了二级结构的模拟，结合局部二级结构分析选择位于mRNA茎环处的siRNA最佳靶位点。5.2慢病毒载体的安全性慢病毒作为外源基因转移的载体已经被广泛应用，慢病毒的制备可能会伴随着可复制病毒(RCV)的产生。人们通过删除或失活一些非必需元件如辅助基因来提高慢病毒载体的安全性。在此基础上HIV-1载体系统发展经历了3个阶段。本研究所使用的是四质粒系统，是一种自我失活的慢病毒载体，即整合入宿主的基因后停止复制自我序列，是改进后的第三代产品，其生物安全性得了很大的提高。(1)表达质粒的3′LTR(△U3)缺失，这种处理不会影响宿主细胞内病毒基因组的生成，但是可以在病毒转化入宿主细胞后发生“自我灭活”。一旦整合入宿主细胞，病毒基因组就不再具备产生可包装的病毒基因组的能力。(2)用VSV-G代替HIV-1的包膜蛋白。(3)编码结构蛋白和包装病毒基因组所需成分的基因被分成4个部分，每一部分之间都没有同源序列，避免产生具有复制能力的病毒。(4)尽管3个包装质粒在293FT细胞中均可表达并形成产物蛋白，但它们都不含有LTRs或Ψ包装序列。这意味着并没有真正的HIV-1结构基因在包装好的病毒基因组中出现，也就不会在转化的宿主细胞中表达，不会产生新的具有复制能力的病毒。(5)包装产生的慢病毒颗粒没有复制能力，只含有目的基因。(6)由于HIV-1的RRE存在于gag/pol的mRNA副本中，致使pLP1中gag和pol的基因表达是Rev依赖性的。在缺乏Rev的情况下加入RRE可防止gag和pol的表达。5.3慢病毒的滴度病毒的滴度是进行后续研究特别是动物试验的重要条件。病毒产物一般冻存于-80℃6结论1、在长度为351bp的猪生长抑素mRNA序列中选择并设计了两条siRNA，并构建了表达发卡siRNA的慢病毒干扰质粒（简称LV-siRNA1和LV-siRNA2）。2、构建了猪生长抑素基因真核表达载体pcDNA3.1-SS。3、将慢病毒干扰质粒与pcDNA3.1-SS分别共转染细胞株，通过RIA检测转染细胞裂解液中SS浓度，证明2条siRNA对SST基因表达均有不同程度的抑制作用，其抑制率分别为87.9%和86.3%，而且LV-siRNA1干扰效率较好。4、本试验利用慢病毒四质粒系统成功包装出假病毒颗粒，经测定病毒原液的滴度达到5×104ifu/ml，超速离心后病毒滴度为5×109ifu/ml。【参考文献】[1]DannC.T.,AlvaradoA.L.,HammerR.E.,GarbersD.L.Heritableandstablegeneknockdowninrats.ProcNatlAcadSciUSA.2006,103(30):11246–11251.[2]DieckhoffB.,KarlasA.,HofmannA.,KuesW.A.,etal.Inhibitionofporcineendogenousretroviruses(PERVs)inprimaryporcinecellsbyRNAinterferenceusinglentiviralvectors.ArchVirol2006,inpress.[3]DieckhoffB,PetersenB,KuesWA.,KurthR,NiemannH,DennerJ.Knockdownofporcineendogenousretrovirus(PERV)expressionbyPERV-specificshRNAintransgenicpigs.Xenotransplantation.2008;15:36-45.[4]GoldingM.C.,LongC.R.,CarmellM.A.,HannonG.J.WesthusinME.SuppressionofprionproteininlivestockbyRNAinterference.ProcNatlAcadSciUSA.2006,103(14):5285-90.[5]HamraF.K.,GatlinJ.,ChapmanK.M.,GrellheslD.M.,GarciaJ.V.,HammerR.E.,GarbersD.L.Productionoftransgenicratsbylentiviraltransductionofmalegerm-linestemcells.ProcNatlAcadSciUSA.2002;99:14931-6.[6]HofmannA.,KesslerB.,EwerlingS.,etal.,EpigeneticRegulationofLentiviralTransgeneVectorsinaLargeAnimalModel.MOLECULARTHERAPY.2006.13(1)：59-66.[7]LavitranoM,CamaioniA,FazioVM,DolciS,FaraceMG,SpadaforaC.SpermcellsasvectorsforintroducingforeignDNAintoeggs:genetictransformationofmice.Cell1989;57:717–23.[8]LenzG.TheRNAinterferencerevolution.JMedBiolRes2005,38(12):1749-1757.[9]LoisC.,HongE.J.,PeaseS.,etal.GermlineTansmissionandTissue-SpecificExpressionofTransgenesDeliveredbyLentiviralVectors.Science,2002,295:868-872.[10]MichalkiewiczM.,MichalkiewiczT.,GeurtsA.M.,RomanR.J.,SlocumG.R.,SingerO.,WeihrauchD.,GreeneA.S.andCowleyJrA.W.Efficienttransgenicratproductionbyalentiviralvector.JPhysiolHeartCircPhysiol.2007,doi:10.1152/ajpheart.00060.2007.[11]NaganoM,WatsonDJ,RyuBY,WolfeJH,BrinsterRL.Lentiviralvectortransductionofmalegermlinestemcellsinmice.FEBSLett.2002,524:111-115.[12]NaldiniL.LentivirusesasGeneTransferAgentsforDeliverytoNon-dividingCells.Curr.Opin.Biotechnol.1998,9,457-463.[13]NishitsujiH.,IkedaT.,MiyoshiH.,OhashiT.,KannagiM.,MasudaT.ExpressionofsmallhairpinRNAbylentivirus-basedvectorconfersefficientandstablegene-suppressionofHIV-1onhumancellsincludingprimarynon-dividingcells.MicrobesandInfection.2004,6,76–85.[14]RamakrishnanVG，AljamaliMN，SauerJR，etal．2005．ApplicationofRNAinterf