DB12T 651-2016 转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测 实时荧光PCR方法

67.050B

23

DB12天津 市地 方标 准DB12/T

651—2016转基因耐除草剂大豆

GTS40-3-2

定量检测

实时荧光

PCR

方法Detection

of

and

—Quanlitative

for

soybean

GTS

40-3-2

and

derivates2016-09-27

发布 2016-11-01

实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T

651—2016 本标准按照

GB/T

给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天津市质量技术监督宝坻检测中心。本标准主要起草人：兰青阔、宛煜嵩、杨炳存、赵新、李亮、陈锐、朱珠、刘娜、王成、徐石勇。本标准

年

9

月首次发布。DB12/T

651—2016

GTS40-3-2

方法1 范围本标准规定了转基因耐除草剂大豆

GTS

转化体特异性定量

PCR

检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。本标准适用于转基因耐除草剂大豆

GTS

及其衍生品种，以及制品中

GTS

转化体的定量

PCR

检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T

转基因植物及其产品检测 通用要求农业部

1485

4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA

农业部

2031

号公告—19—2013 转基因植物及其产品检测 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1Lectin

Lectin

编码大豆凝集素的基因。3.2

转化体特异性序列

40-3-2GTS

外源插入片段

5′

启动子部分序列和大豆基因组的部分序列。4原理根据大豆外源基因和内标基因特异性序列设计引物和

荧光探针，对标准样品和试样同时进行实时荧光

PCR

扩增。根据标准样品模板拷贝数与

Ct

值间的线性关系，分别绘制外源基因和内标基因的标准曲线。计算试样中外源基因和内标基因的拷贝数及其比值。5 检测方法5.1

试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合

GB/T

6682

规定的一级水。5.1.1

PCR

反应试剂盒。DB12/T

651—20165.1.2引物和探针。5.1.2.1

基因。lec-1215F：5′′lec-1332R：5′′lec-1269P：5′-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-3′预期扩增片段大小为

（参见附录

A）。5.1.2.2

转化体特异性序列。GTS40-3-2F：5'-

CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG

-

3'：

GACTTGTCGCCGGGAATG

-

3'：5'

-CGCAACCGCCCGCAAATCC-

3'预期扩增片段大小为

121

（参见附录

A

10

µmol/L需避光保存。5.2 仪器

g

和

PCR

其他相关仪器设备。5.3 分析步骤5.3.1 按

NY/T

672

和农业部

2031

号公告—19—2013

规定执行。5.3.2 试样准备按

NY/T

672

和农业部

2031

号公告—19—2013

规定执行。5.3.3 试样预处理按农业部

1485

号公告—4—2010

规定执行。5.3.4 DNA

模板制备按农业部

1485

号公告—4—2010

规定执行。5.3.5 标准曲线样品制备采用相同的标准样品绘制

转化体和

内标基因的标准曲线。提取

标准物质基因组

DNA

0.1×TE

或水稀释至

1×10

copies/µL（相当于

20-100

ng/µL模板。然后再用

0.1×TE

梯度稀释初始模板，制备不同浓度的

标准溶液。标准溶液至少涵盖

5

个

浓度梯度，最低浓度拷贝数小于

200，最高浓度拷贝数大于

40000。5.3.6PCR

反应5.3.6.1 标准样品和试样实时荧光

PCR

同时进行标准样品和试样的

PCR

反应，每个

PCR

反应设置

3

转化体实时荧光

PCR

1

在

PCR

反应管中依次加入反应试剂，混匀；

内标基因实时荧光

PCR

反应按

10

GTS40-3-2F0.8

2.0

10

GTS40-3-2R0.8

2.0

10

GTS40-3-2P0.4

.0

2.0

25.0

25.0

10

lec-1215F0.2

0.5

10

lec-1332R0.2

0.5

10

lec-1269P0.2

0.5

.0

25.0

25.0

DB12/T

651—2016表

2

在

PCR

反应管中依次加入反应试剂，混匀。将

PCR

管放在离心机上，500

g~3

000

g

离心

10

s，然后取出

PCR

管，放入

PCR

仪中。运行实时荧光

PCR

反应。反应程序为：95℃变性

2

；进行

95℃变性

15

s，60℃退火延伸

1

60

光信号。表

1表

1

PCR

反应体系表

2 Lectin

PCR

反应体系

DNA

作为

转化体特异性检测的阴性对照的模板；以鲑鱼精子

DNA

内标基因检测的阴性对照的模板；用纯水作为空白对照

PCR

PCR

PCR

反应条件与

相同。5.3.7 数据分析5.3.7.1

设定阈值实时荧光

PCR

反应结束后，以

PCR

刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好。5.3.7.2

Ct

值

n

n

(2)DB12/T

651—2016设定阈值后，荧光定量

PCR

仪的数据分析软件自动计算每个反应的

Ct

值，并记录。5.3.7.3

绘制标准曲线

Ct

转化体和Lectin

内标基因的标准曲线。标准曲线公式：式中：y—测试样品的

Ct

a—标准曲线的斜率；x—模板拷贝数以

10

为底数的对数；b—标准曲线的截距。5.3.7.4

数据可接受的标准

阴性对照和空白对照的

转化体

Ct

值≥38；Lectin

阴性对照和空白对照的Lectin

内标基因

Ct

38

R

以进行结果计算。否则重新进行实时荧光

PCR

扩增。5.3.7.5

含量计算5.3.7.5.1

计算试样模板拷贝数将试样的

转化体和

内标基因的

Ct

值分别带入

转化体和

Lectin

内标基因的标准曲线方程，计算

转化体和大豆内标准基因

的拷贝数。计算试样模板拷贝数公式：ba式中：n—模板拷贝数y—测试样品的

Ct

a—标准曲线的斜率；b—标准曲线的截距。5.3.7.5.2

计算试样中转基因含量将

转化体拷贝数和

3

百分含量。计算试样中

转化体百分含量的公式：×100 % (3)式中：c—试样中

的百分含量(%)；n—GTS40-3-2

转化体拷贝数；n—大豆内标准基因

拷贝数。DB12/T

651—20166 结果分析与表述6.1

Lectin

内标基因和

GTS40-3-2

内标基因和

转化体的

Ct

值<36

转化体，

转化体含量为

c”。6.2

内标基因出现典型扩增曲线，且

Ct

值<36，

转化体

Ct

值38

或未出现典型扩增

转化体”。6.3

Lectin

内标基因和

GTS40-3-2

转化体出现典型扩增曲线，

内标基因

值<36，

转化体

Ct

36～38

之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合

6.1-6.2

的情况，依照

6.1-6.2

进行判断；如重复实验

转化体出现典型扩增曲线，但

Ct

值仍在

36～38

之间，则判定样品检出

转化体，表述为“样品中检测出

转化体”

。6.4

Lectin

内标基因和

GTS40-3-2

转化体未出现典型扩增曲线，或

Ct

值38，表明样品中未检出大豆。6.5

Lectin

内标基因和

GTS40-3-2

Ct

值均在

36～38

验。如重复实验结果符合

6.1-6.4

的情况，依照

6.1-6.4

进行判断；如重复实验

内标基因和

Ct

值仍在

36～

转化体，表述为“样品中检测出

DB12/T

651—2016附录A（资料性附录）A.1 Lectin基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（Accession

No.K00821）1

CCACATTTGG

CCGGTAGCGT

TGCCAGCTTC61

GCCGCTTCCT

CTTCTATGCC

AAAGGC