一种检测围产期母羊胰岛素敏感的方法-葡萄糖钳夹技术

2一种检测围产期母羊胰岛素敏感的方法-葡萄糖钳夹技术本文件规定了围产期母羊胰岛素敏感检测方法的试剂、仪器和设备、测定步骤。本文件适用于围产期母羊胰岛素敏感的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1胰岛素敏感insulinsensitivity指脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞对正常浓度的胰岛素产生反应不足的现象，亦即这些细胞需要更高的胰岛素浓度才能对胰岛素产生反应。2.2高胰岛素-正血糖钳夹技术hyperinsulinemiceuglycemicclamptest一种金标准方法，即给予一定量的胰岛素后，将葡萄糖用某种速率滴注入血液，部分葡萄糖能被利用，但血糖水平可维持稳态。3试剂3.1牛源胰岛素（购自美国sigma公司）。3.2牛血清白蛋白（BSA，购自美国sigma公司）。3.3生理盐水。3.4浓度为10%的葡萄糖注射液。3.5浓度为50%的葡萄糖注射液。3.6葡萄糖灌注液：10%糖盐溶液与50%的葡萄糖注射液按5:3的比例配制成25%（w/v)的葡萄糖灌注液。3.7胰岛素灌注液：胰岛素的用量为120μg/h。调节注射泵的速度，使胰岛素灌注液以10mL/h的速度恒流灌注，灌注量为120μg/h。首先1mL无菌水中加入1mg胰岛素与0.01gBSA，并充分混合，随后，再加入50μL6N盐酸制备为冻存液。再次，取2.88mL冻存液加入含0.1%BSA的生理盐水稀释至240mL，再用0.22μm的一次性抽滤瓶负压过滤除菌，配制成灌注液待用。4仪器和设备4.1恒流泵（上海沪西分析仪器厂，型号HL-2）。34.2注射泵（保定兰格恒流泵有限公司，型号W0109-1B）。4.3快速测血糖仪（美国强生公司，强生稳步型）。4.40.22μm的一次性负压抽滤瓶。4.5输液管。4.6一次性静脉留置针。5测定步骤5.1饲养管理正式试验前一周对母羊进行适应性训练，在代谢笼中饲养，自由饮水，每隔两小时饲喂一次，为避免采食量变化对机体血糖水平的影响，需要对动物定量限饲。5.2安装静脉留置针灌注前一天，动物的一侧颈静脉安装静脉留置针建立静脉输注通道，该通道连接三通管，一端连接注射胰岛素，一端连接葡萄糖输注泵，混合后输注静脉。同时，在动物的另一侧颈静脉安装留置针用于采集血样。5.3胰岛素与葡萄糖的灌注胰岛素的灌注使用注射泵调节，保证胰岛素灌注液以10mL/h的速度恒流灌注入颈静脉中。葡萄糖的灌注液使用恒流泵调节，灌注速率随机体血糖水平的变化调节，使机体血糖水平保持稳定。5.4血样的采集灌注前一天，分别于07:30、08:30、13:30、14:30、19:30和20:30六个时间点采集血样，用快速测血糖仪测定血糖浓度，确定基础血糖水平。在灌注期，葡萄糖，胰岛素灌注后每隔10min测定一次血糖，并根据血糖浓度调节目标血糖水平，使其稳定在基础血糖水平。待血糖稳定后，每隔1h采一次血样测定血糖并留样。钳夹结束时，首先停止泵入胰岛素，预防低血糖发生，然后逐渐减少葡萄糖输入速度。5.5血样的处理采集的血样中加入肝素钠抗凝，低速台式离心机3000rpm，离心15min，取血浆以分析胰岛素和血糖浓度。5.6血样的测定指标与方法动脉血浆胰岛素浓度采用放射性免疫法测定，按照附录A中的简要操作方法进行测定。血浆葡萄糖浓度使用全自动生化分析仪测定，按照附录B中的简要操作方法进行测定。4附录A胰岛素浓度简要测定步骤1试剂配制1.1Ins.标准品：向各标准瓶中分别准确地加入1mL缓冲液溶解。溶解15min后摇匀方可使用。溶解后各标准浓度分别为5、10、20、40、80、160μIU/mL。1.2125I-Ins.：用10mL缓冲液溶解。1.3豚抗-Ins.抗体：每瓶抗体加10mL缓冲液溶解。1.4驴抗豚免疫分离剂：加样前必须充分摇匀。1.5Ins.质控血清：使用前每瓶准确加入0.5mL蒸馏水溶解。2测定步骤取圆底聚苯乙烯试管若干，用记号笔编号NSB、S0-S6和待测样品管等，然后用微量加样器按表A.1所示加样。加样前所有试剂（尤其是分离剂）包括待测样品均要摇匀，并且最好平衡到室温。表A.1加样程序表单位：μlI-Ins.————3数据处理联机处理：由电脑自动处理得出结果。葡萄糖浓度简要测定步骤1参数设置波长：505nm。2