DB12T 521-2014 牛结核病噬菌体检测技术规范

11.220B

41

DB12

牛结核病噬菌体检测技术规范

tandard

天津市质量技术监督局发布DB12/T

521—2014前 言本标准的编写符合

GB/T1.1-2009

本标准由天津市畜牧兽医局提出。本标准由天津市动物卫生监督所起草。本标准主要起草人：刘子芝、赵勇、李志荣、刘纪艳、尹望中、杨建华、周永燚、王颖、赵晶。本标准于年4IDB12/T

521—2014牛结核病噬菌体检测技术规范1

范围判定、注意事项。本标准适用于牛结核病的疫病普查、监测和诊断。2

规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T

541 动物疫病实验室检验采样方法3

定义3.1噬菌体

Bacteriophage,简称

phage噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。3.2噬菌斑

plaque在人工培养基上，细菌在噬菌体的作用下裂解形成的圆形斑，称为噬菌斑。4

设备和仪器a

生物安全柜b

离心机（4000

）c

振荡器d

水浴锅（55

e

恒温培养箱f

有盖离心管（50

）g

无菌试管（10

）h

移液管（10

）i

三角瓶（100

，500

）j

平皿（

）k

移液器及配套吸头（100

μL，1000

μL）5

培养基和试剂培养基和试剂配制方法见附录

A6

检测6.1

样本的采集1DB12/T

521—2014按照NY/T

进行样本采集。6.2

样本的处理6.2.1

牛乳取牛乳

5

于

50

有盖离心管中，加

10

的

15

；加灭菌完全培养基至

30

，4000

r/min

离心

15

30

，4000r/min

离心

15

后弃去上清液；加

1

灭菌完全培养基重悬沉淀物，无菌条件下转移至

10

无菌试管中。6.2.2

口鼻分泌物取2

2

50

方法同6.2.1。6.3检测6.3.1

1

灭菌完全培养基于

6.3.2

50

μL指示细胞溶液用灭菌完全培养基稀释至1.0×10，取1

稀释后的溶液于10

6.3.3

6.2.1。6.3.4

100

μL噬菌体37

℃水浴锅中孵育2

h；6.3.5

上述反应管中分别加

μL杀病毒剂，充分混匀，置于室温10

；6.3.6

上述反应管中分别加8

完全培养基，混匀；6.3.7

上述反应管中分别加1

指示细胞溶液，混匀；6.3.8

快速将反应管中所有的内容物分别倒入相应的空的90

mm的无菌平皿中；立即加8

冷却至55℃左右的琼脂培养基于各平皿中，快速混匀，置于室温定型；6.3.9

将平皿倒置于3718

h后判读结果。7结果判定当阳性对照平皿中噬菌斑数目≥2010互融合成透明状判定为阳性；平皿中无噬菌斑出现或噬菌斑数量＜208 注意事项8.1

8.2

加入杀毒剂后一定要彻底摇匀，以杀死全部未进入菌体里的噬菌体。8.3

接接触移液器，正确使用手套、生物安全罩衣、口罩等相应的安全防护设施。8.4

2DB12/T

521—2014自购，用无菌完全培养基将噬菌体D29调至工作浓度为1.0×10

Pfu/mL，4℃保存备用。

自购，用无菌完全培养基将噬菌体D29调至工作浓度为1.0×10

Pfu/mL，4℃保存备用。

cfu

/mL，（规范性附录）培养基和试剂配制方法A.1

Middlebrook7H9

基础培养基将Middlebrook7H9基础培养基（自购）4.7

g加入900

mL蒸馏水（或去离子水）中，充分混匀，溶

弃用。A.2 完全培养基

4℃保存备用，有效期4周。如该溶液污染（浑浊），则弃用。A.3

3%

NaoH溶液取NaoH

30

g，溶于1000

min，冷却后备用。A.4 噬菌体D29溶液8A.5

指示细胞溶液64℃保存备用。A.6 杀病毒剂将50

mL浓硫酸加入到800

g硫酸亚铁铵。在容量瓶中稀释到1000

mL