DB12∕T 653-2016 鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光PCR法

67.050B

45

DB12天 津 市 地 方 标 准DB12/T

653—2016鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光

PCR

法Quantitative

method

for

in

and

products2016-09-27

发布 2016-11-01

实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T

653—2016 本标准按照

GB/T

给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石勇。本标准

年

9

月首次发布。DB12/T

653—2016

1 范围

PCR

检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。本标准适用于生鲜、冷冻畜禽肉中动物源性成分的定量

PCR

检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光

PCR real

PCR实时荧光

PCR

PCR

反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个

PCR

对未知模板进行定性或定量分析。3.2Ct

值

time每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3内参基因

3.4牛源性成分

牛种属特异性

DNA

片段。3.5羊源性成分

羊种属特异性

DNA

片段。3.6猪源性成分

猪种属特异性

DNA

片段。3.7鸡源性成分

鸡种属特异性

DNA

片段。3.8鸭源性成分

鸭种属特异性

DNA

片段。16SrDNA16S-F5′

3′16S-R5′

3′16S-P

82

bpRd1Rd1-F

-3Rd1-R

-3

CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-BHQ1-395

bpOA-PRLP

88

bpSus-ACTBSus-F

-3Sus-R

-3

-BHQ1-3103

Chk

-3-3

62

bpDuc

-3

-3

80

bpDB12/T

653—20164 原理根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的

DNA

特征序列，筛选种间保守区域设计一对通用引物和种内特异

DNA用

实时荧光

PCR

技术，根据标准参照物模板含量与

Ct

值间的线性关系，绘制标准曲线，计算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。5 检测方法5.1

试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合

GB/T

6682

规定的一级水。5.1.1 DNA

提取用试剂5 10三氯甲烷；异戊醇；乙酸钠；无水乙醇；

饱和酚；裂解液：10

（

5 1025

（），

g/LSDS，

g/L蛋白酶K；TE缓冲液（、

（

8.0），1

（pH8.0）。5.1.2

PCR

反应试剂盒5.1.3 引物和探针。

3用水分别将上述引物和探针稀释到

µmol/L

A，

探针引物其

53用水分别将上述引物和探针稀释到

µmol/L

A，、BHQ1

等）。5.1.4 阳性对照用已知含相应动物源性成分的样品作阳性对照。DB12/T

653—20165.1.5 双蒸水。5.2 仪器荧光定量

PCR

扩增仪；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；分析天平，感量

0.1

g

和

0.1

12000

g0.5µL～10µL，10µL～100µL，10µL～200µL，100µL～1000µL；实时荧光

反应管；重蒸馏水发生器或纯水仪；恒温水浴箱。5.3 分析步骤5.3.1

g

作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。将试样于℃冷冻保存。5.3.2 DNA

提取

加入

2

μLSDS

裂解液和

20

μL

蛋白酶

K（20

55℃水浴消化数小时，期间不停颠倒混匀，直至

12000

rpm

10

，

1

倍体积的

饱和酚和

倍体积的氯仿/24:1），缓慢颠倒混匀，12000

rpm

离心

，转移上清至一新离心管；加入

倍体积的乙酸钠溶液和

2.5倍体积

4

DNA

絮状沉淀析出，

℃沉淀

2

h；12000

rpm离心

5

，加入

500

μL

70%乙醇洗涤沉淀；室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入

100

μL

TE

液溶解

DNA

沉淀。5.3.3 标准曲线样品制备采用牛、羊、猪、鸡、鸭相应的标准品绘制种属特异性基因和

16SrDNA

内参基因的标准曲线。提取动物源性成分标准物质基因组

DNA，用

0.1×

或水稀释梯度稀释，标准溶液至少涵盖

5

个动物源性成分浓度梯度。5.3.4 PCR

反应5.3.4.1 标准样品和试样实时荧光

PCR

同时进行标准样品和试样的

PCR

反应，每个

PCR

反应设置

3

次平行。动物源性成分种属特异性基因实时荧光

PCR

2

在

PCR

反应管中依次加入反应试剂，混匀；

内参基因实时荧光

PCR

反应按表

3

在

PCR

PCR

管放在离心机上，

g~3

g

离心

10

s

PCR

PCR

PCR

℃变性

2

；进行

次循环扩增反应（95℃变性

s，60℃退火延伸

1

60

℃）时段收集荧光信号。

10

0.8

2.0

10

0.8

2.0

10

0.4

1.0

1.0

25.0

25.0

10

16S-F0.4

1.0

10

16S-R0.4

1.0

10

16S-P0.2

0.5

1.0

25.0

25.0

DB12/T

653—2016表

2 动物源性成分种属特异性基因

PCR

反应体系表

3 表

3 16SrDNA

内参基因

PCR

反应体系应设置阴性对照和空白对照。以鲑鱼精子

DNA

作为阴性对照

PCR

反应体系的模板用纯水作为空白对照PCR

PCR

PCR反应条件与

相同。5.3.5 数据分析5.3.5.1

设定阈值实时荧光

PCR

PCR

情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好。5.3.5.2

Ct

值设定阈值后，荧光定量

PCR

仪的数据分析软件自动计算每个反应的

Ct

值，并记录。5.3.5.3

绘制标准曲线根据标准溶液的扩增

Ct

值和初始模板含量的对数间的线性关系，分别绘制动物源性成分种属特异性基因和

16SrDNA

内参基因的标准曲线。

n

(2)

n

(2)标准曲线公式：式中：y—测试样品的

Ct

a—标准曲线的斜率；x—模板靶标浓度以

10

为底数的对数；b—标准曲线的截距。5.3.5.4

数据可接受的标准动物源性成分种属特异性基因阴性对照和空白对照的

Ct

38；16SrDNA

阴性对照和空白对照的

16SrDNA

内标基因

Ct

值≥38；标准曲线的

R，标准曲线斜率≥

且≤

件，可以进行结果计算。否则重新进行实时荧光

PCR

扩增。5.3.5.5

含量计算5.3.5.5.1

计算试样模板靶标浓度将试样的动物源性成分种属特异性基因和

内参基因的

值分别带入动物源性成分种属特异性基因和

内参基因的标准曲线方程，计算动物源性成分种属特异性基因和

内参基因的靶标浓度。计算试样模板靶标浓度公式：ba式中：n—模板靶标浓度y—测试样品的

Ct

a—标准曲线的斜率；b—标准曲线的截距。5.3.5.5.2

计算试样中动物源性成分种属特异性基因含量将动物源性成分种属特异性基因的靶标浓度和

16SrDNA

3），计算出试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量。计算试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量的公式：式中：c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量；n

（Rd1、

、、Duc）—动物源性成分种属特异性基因靶标浓度；n—内参基因

浓度。6 结果分析与表述6.1

内参基因和动物源性种属特异性基因的

Ct

值<36，表明样品中检出某动物源性成分。表述为“样品中检测出某动物源性成分，某动物源性成分含量为

c”。DB12/T

653—20166.2

内参基因出现典型扩增曲线，且

Ct

值<36，动物源性种属特异性基因

Ct

值

或未出现6.3

16SrDNA

内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，16SrDNA

内参基因

Ct

值<36，动物源性种属特异性基因

Ct

36～38

6.1-6.2

的情况，依照

进行判断；如重复实验动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但

Ct

值仍在

36～6.4

16SrDNA

内参基因和动物源性种属特异性基因未出现典型扩增曲线，或

Ct

值38，表明样品中未6.5

内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但

Ct

值均在

36～38

之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合

6.4

的情况，依照

6.1-

6.4

进行判断；如重复实验

内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但

Ct

值仍在

～

之间，则判定样品检出DB12/T

653—2016附录A（资料性附录）A.1 牛种属特异性基因实时荧光扩增产物核苷酸序列1

GTAGGTGCAC

GAAGCTACTT

GATGCCAAAC

GGCACACTCG61

GCTGTGTTCC

TTGCCGTCAT

GTGCCCAGTC

TGGCC

Rd1-R

Rd1-P

A.2 羊种属特异性基因实时荧光扩增产物核苷酸序列1

CCAACATGCC

CAAAAACCAT

TGAGACTGGC

GGGGAAGGAA

AGGCAGCCAA61

ACAGAGCGAG

OA-P

A.3 猪种属特异性基因实时荧光扩增产物核苷酸序列1

GGAGTGTGTA

GCACAGTAGG

CTCCCCGACC

TGGGGTCCCC61

AGCACACTTA

TTGCACTCTC

CAG

Sus-R

Sus-P

A.4 鸡种属特异性基因实时荧光扩增产物核苷酸序列1