DB36-T 1964-2024 新型冠状病毒基因溯源技术规范

C05DB36Genetictraceabilitytechnicalspecificationfo江西省市场监督管理局发布IDB36/T1964—2024 32规范性引用文件 33术语和定义 34样本采集 35样本运输与管理 46全基因组测序 57序列生成 68结果解读与溯源 6 7DB36/T1964—2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省卫生健康委员会提出。本文件由江西省卫生健康标准化技术委员会（JX/TC037）归口。本文件起草单位：江西省疾病预防控制中心。本文件主要起草人：施勇、李健雄、刘师文、肖芳、徐刚、冉鑫、肖大瑾、周珺、张艳妮、刘晓庆、吴杨博文、王倩、邱伟华、熊英。3DB36/T1964—2024新型冠状病毒基因溯源技术规范本文件规定了新型冠状病毒基因溯源的样本采集、样本运输与管理、全基因组测序、序列生成、结果解读与溯源等内容。本文件适用于承担新型冠状病毒基因溯源相关工作的机构开展基因溯源工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233病原微生物实验室生物安全通用准则WS/T776农贸(集贸)市场新型冠状病毒环境监测技术规范关于加强高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理的通知赣卫科教发〔2009〕12号3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1新型冠状病毒SARS-CoV-2引起新型冠状病毒感染的病原体,为冠状病毒属的一个种。3.2全基因组测序wholegenomesequencing对生物样本整个基因组序列进行测定，获得完整的基因组信息。3.3基因溯源genetictraceability利用生物信息学的分析手段对生物样本的基因组序列进行进化分析，获得该生物样本的系统进化关4样本采集4DB36/T1964—20244.1样本选取原则结合流行病学调查信息和病例传播链关系，应选择核酸检测结果Ct值≤32且符合以下条件之一的样本优先开展测序：a)聚集性疫情的首代病例及流行病学关联的关键病例；b)重症和死亡病例；c)65岁以上年龄组病例和免疫功能低下人群；d)无基础性疾病的16~60岁人群出现严重疾病的病例；e)新型冠状病毒感染后临床特征、流行特征发生异常变化的典型病例；f)输入性病例、物品及相关环境阳性样本。4.2样本类型4.2.1病例应采集急性期呼吸道样本，包括上呼吸道样本（鼻咽拭子、口咽拭子等）或下呼吸道样本（深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、呼吸道吸取物等），重症病例宜优先采集下呼吸道样本。4.2.2环境样本应采集物体表面样本或污水样本。4.3采集方法及要求4.3.1病例样本采集可参照《江西省疾控机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》第二版的相关要求进4.3.2同一病例应同时采集2份鼻咽拭子或口咽拭子放置在1个釆样管内，以提高病毒载量用于病毒基因组测序。4.3.3环境样本采集可参照WS/T776的相关要求进行。4.3.4宜采用非灭活病毒采样管进行采样。4.3.5采样管应包装完好，并在有效期内。5样本运输与管理5.1运输要求5.1.1非灭活病毒采样管采集的样本属于A类感染性物质，联合国编号为UN2814，包装参照世界卫生组织《感染性物质运输规章指导》的PI620分类包装要求。5.1.2环境样本属于B类感染性物质，联合国编号为UN3373，包装参照世界卫生组织《感染性物质运输规章指导》的PI650分类包装要求。5.1.3灭活病毒采样管采集的样本参照《关于进一步做好新冠病毒实验室生物安全管理工作的通知》的要求，按照非感染性物质管理。5.1.4新型冠状病毒潜在感染性物质运输应按照《关于加强高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理的通知》要求，取得准运证书后，方可运输。5.2样本管理5.2.1新型冠状病毒样本检测前应专人集中管理，准确记录样本的来源、种类、数量，编号登记、建立台账，采取有效措施确保样本的安全，严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。5.2.2样本应尽快进行检测，24h内检测的样本可置于2℃~8℃保存；24h内无法检测的样本则应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件，则于2℃~8℃冰箱暂存，最长不超过72h)。5DB36/T1964—20246全基因组测序6.1实验室生物安全及个人防护6.1.1实验室应依据GB19489和WS233管理要求，确保实验室生物安全和运行有效性。6.1.2实验室人员应按照WS233的要求，根据所操作感染性物质的防护等级，选择相适应的防护装备进行防护。6.1.3可参照《关于进一步做好新冠病毒实验室生物安全管理工作的通知》文件的要求，新型冠状病毒培养、动物感染实验应当在生物安全三级及以上实验室开展；未经培养的感染性物质、灭活物质的操作，应当在生物安全二级及以上实验室进行，其中未经95℃加热15min灭活或固定的人体和动物组织样本的操作应当在三级及以上实验室开展；无感染性物质的操作可以在生物安全一级实验室进行。6.2实验准备6.2.1设备设备应包括但不限于核酸提取仪、PCR扩增仪、核酸定量仪、高通量测序仪及相应的辅助设备，设备应校准合格，并定期维护。6.2.2试剂试剂应包括但不限于核酸提取试剂盒、核酸定量试剂盒、新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒、核酸纯化磁珠、文库制备试剂盒、高通量测序试剂盒，无水乙醇等，试剂应在有效期内使用。6.2.3耗材耗材应包括但不限于微量移液器、不同规格滤芯吸头、磁力架、1.5mLEP管、0.2mLPCR管、96孔PCR板等，耗材应在有效期内使用。6.3基因测序6.3.1核酸提取病毒RNA提取宜使用核酸提取试剂盒，根据试剂盒说明书提取核酸。6.3.2靶向扩增应采用新型冠状病毒全基因组捕获试剂盒，并根据试剂盒说明书对新型冠状病毒核酸进行靶向扩增。6.3.3扩增产物的纯化应使用核酸纯化磁珠对扩增产物进行纯化。6.3.4纯化产物的定量应使用核酸定量试剂盒对纯化产物进行核酸定量。6.3.5文库构建应根据使用的高通量测序仪选择相匹配的文库制备试剂盒进行文库制备。6DB36/T1964—20246.3.6上机测序根据高通量测序试剂盒和高通量测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序。7序列生成7.1应去除测序数据中的PCR引物序列、接头（adapter）和低质量的测序数据，引物序列按照最大引物长度30bp进行剪切（trim)。7.2应对下机数据进行质量控制（QC）分析，判断测序质量是否达到仪器设备的QC值要求。7.3应以SARS-CoV-2参考基因组(GeneBank序列获得号：NC_045512)为模板进行序列拼接，拼接之后对测序覆盖度和测序深度进行分析，测序覆盖度应≥96%，测序深度应≥100，最终生成一致性(consensus)序列，即为待溯源样本的全基因组序列。8结果解读与溯源8.1应将待溯源样本的全基因组序列同SARS-CoV-2参考基因组(GeneBank序列获得号：NC_045512)进行比对，分析出变异位点。8.2将待溯源样本的全基因组序列同数据库中的全基因组序列数据进行比对。8.3利用生物信息学分析工具对序列进行进化分析，获得该序列的系统进化关系。8.4根据序列进化分析结果，结合流行病学调查信息，对该待溯源样本进行综合分析判断，分析引起疫情的病毒来源，得出溯源结论。