溶血性曼氏杆菌诊断技术规范

1溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范本文件规定了溶血性曼氏杆菌病的诊断技术。本文件适用于牛、羊饲养场(户)和动物诊疗单位对牛、羊临床样本和分离培养物中溶血性曼氏杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。Mh：溶血性曼氏杆菌（Mannheimiahaemolytica）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）bp：碱基对（basepair）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TSA：胰蛋白胨大豆琼脂（trypticsoyagar）TSB：胰蛋白胨大豆肉汤（trypticsoybroth）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）5流行病学由溶血性曼氏杆菌引起的牛、羊呼吸道疾病一年四季均发，秋冬季多见。6临床诊断26.1临床症状发病牛、羊主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、流涕，并伴有体温升高、精神沉郁、厌食等。发病初期动物呼吸速率加快，继而出现严重的呼吸困难，呼吸伴有啰音。6.2病理变化临床病理变化以纤维素性渗出性肺炎、大叶性肺炎和胸膜肺炎为主。剖解后可见以下病理变化中一项或多项：病变肺质地坚实、间质增宽水肿、胸腔脏层和壁层均有纤维素附着、胸腔积液呈黄色或红黄色、肺胸腔黏连。6.3结果判定牛、羊出现6.1或6.2的情况，可判定为疑似溶血性曼氏杆菌感染。确诊应采集有临床症状或病理变化的牛羊鼻拭子、肺脏等组织或无菌采集血清，按实验室诊断方法确诊。7实验室诊断样品的采集与处理7.1器材7.1.1冷冻高速离心机。7.1.2组织匀浆器或研磨器。7.1.3手术剪刀和镊子。7.1.4一次性密封袋。7.1.55mL冻存管。7.1.62mL冻存管。7.1.7采血针。7.1.8促凝采血管。7.2试剂7.2.1TSB培养基（配制方法见附录A中的A.1）。7.2.20.01mol/LPBS溶液（配制方法见A.2）。7.2.375%酒精。7.3病料采集7.3.1将棉签伸入鼻腔内吸取分泌物，所有拭子采完后分别放入盛有3mLTSB培养基的5mL冻存管中，编号，记录。采集的样品密封后，采用保温箱加冰密封后运送到实验室。7.3.2采集新鲜解剖的未破损的牛、羊肺脏，气管注入50mL～100mL灭菌的0.01mol/LPBS溶液,轻揉肺脏3min～5min,转移5mL～10mL灌洗液分装至2mL灭菌的冻存管中，采用保温箱加冰密封后运送到实验室。37.3.3将发病牛、羊剖检后取肺、脾、肝等脏器和淋巴结组织，编号，记录。采集的样品密封后，采用保温箱加冰密封后运送到实验室。7.3.4采用75%酒精对待采血动物颈部静脉表面皮肤进行擦拭消毒。用无菌采血针于颈静脉处采血，立即插入促凝采血管中，充分混匀后编号、记录，采用保温箱运送到实验室。7.4样品处理7.4.1将采集鼻拭子中的棉签拧干取出，5000r/min,离心20min。用5mL注射器吸出拭子液上清，分装到2mL灭菌的冻存管中。贴标签-80℃冰箱保存。7.4.2将组织样品分解成2×2×3cm大小，将上述组织块，用无菌剪刀剪碎后，加入5mL保存液，研磨成组织悬液冻融3次或超声波裂解，8000r/min，离心20min。用5mL注射器吸出上清，分装到2mL灭菌的冻存管中。贴标签-80℃冰箱保存。7.4.3在4℃下，促凝管5000r/min,离心20min，取血清，分装到2mL灭菌的冻存管中。贴标签-80℃冰箱保存。8细菌分离与鉴定8.1器材8.1.1高压灭菌锅。8.1.2恒温培养箱。8.1.3光学显微镜。8.1.4生物安全柜。8.1.5细菌培养皿。8.2试剂8.2.1TSA培养基（配制方法见A.3）。8.2.2革兰氏染色试剂：草酸铵结晶紫染色液、番红染色液、碘液和95%酒精，2℃~8℃条件下保存。8.2.3葡萄糖、阿拉伯糖、靛基质等微量生化鉴定管，2℃~8℃条件下保存。8.3细菌分离8.3.1在无菌条件下，用接种环将按一定比例稀释的鼻拭子液、支气管肺泡灌洗液或发病牛羊的肺、脾、肝等组织材料划线接种于TSA平板中，37℃培养24h，使之形成菌落，以供鉴定用。8.3.2取8.3.1中培养的圆形、光滑、湿润和半透明菌落，在TSA平板上进行划线接种纯培养，37℃培养24h后，出现上述菌落（见附录B.1）。8.4涂布染色镜检8.4.1涂布：在载玻片上滴加1～2滴灭菌蒸馏水后，用接种环挑取纯培养的少量细菌与灭菌蒸馏水混匀并涂成薄菌膜。48.4.2干燥：将涂片至于空气中自然晾干。8.4.3固定：将已干燥的载玻片涂面朝上，在酒精灯火焰上通过1～2次进行固定，不可过热，以载玻片不烫手为宜。8.4.4染色：采用革兰氏染色法进行染色，一般包括初染、媒染、脱色和复染四个步骤，置1000倍（10×100）光学显微镜下观察。8.4.5镜检：溶血性曼氏杆菌为革兰氏阴性的球杆菌，菌体大小（0.3～0.5）µm×（1.0～1.8）µm，无芽孢、无鞭毛，有荚膜，可见两极着色（见附录B.2）。8.5生化鉴定溶血性曼氏杆菌可发酵葡萄糖、麦芽糖、木糖、蔗糖和甘露醇，不发酵海藻糖和阿拉伯糖，靛基质试验、鸟氨酸脱羧酶试验和脲酶试验阴性，可作进一步鉴定。9PCR检测9.1器材9.1.1PCR扩增仪。9.1.2电泳仪。9.1.3水平电泳槽。9.1.4凝胶成像系统。9.1.51.5mL离心管。9.1.60.2mLPCR薄壁管或八联管。9.2试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯。试验用水均符合GB/T6682-2008三级水规定。9.2.1细菌基因组DNA提取试剂盒，常温条件下保存。9.2.2琼脂糖（电泳级），2℃~8℃条件下保存。9.2.3DNA分子量标记DL1000，-20℃保存。9.2.4阴性对照、阳性对照：阴性对照为灭菌超纯水；阳性对照为灭活的溶血性曼氏杆菌标准菌株。9.2.5PCR扩增用上、下游引物序列（见附录B.3）。9.3细菌基因组DNA提取将初步鉴定为溶血性曼氏杆菌的菌株用商品化试剂盒进行基因组DNA提取。提取方法按试剂盒说明书进行。9.4PCR扩增每次进行PCR扩增时，除检测样品外，均需设置阳性对照和阴性对照。5PCR反应体系：9.4.12×PCR反应预混液12.5µL，模板DNA（空白对照用水代替）2µL，上下游引物各0.5µL，ddH2O补足至25µL。9.4.2PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环，72℃总延伸10min。9.5PCR产物电泳用1×TAE电泳缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶。取5µLPCR产物分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入DNA分子量标准（DL1000），以5V/cm恒压电泳，30min后采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。9.6PCR结果判定9.6.1阳性对照出现一条230bp大小的条带，且阴性对照不出现条带。9.6.2在满足9.6.1的条件下，被检样品的PCR产物经电泳后出现一条230bp的条带判定为核酸阳性（+）；被检样品的PCR产物经电泳后不出现230bp的条带判定为核酸阴性（-）。10间接ELISA抗体检测10.1器材10.1.1酶标仪。10.1.2洗板机。10.2试剂10.2.1包被抗原：大肠杆菌表达的溶血性曼氏杆菌LktA重组蛋白。10.2.2酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的驴抗绵羊二抗，兔抗牛二抗。10.2.3对照：Mh阳性血清、Mh阴性血清。10.2.4包被缓冲液（配制方法见A.4）。10.2.5封闭缓冲液（配制方法见A.5）。10.2.6洗涤缓冲液（配制方法见A.6）。10.2.7稀释缓冲液（配制方法见A.7）。10.2.8TMB显色液（配制方法见A.8）。10.2.9终止液（配制方法见A.9）。10.3检测步骤10.3.1包被酶标板Mh重组LktA蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.5μg/mL，每孔100µL包被96孔酶标板，4℃包被16h。用洗涤缓冲液洗板5次，每孔200µL，每次3min，洗涤结束后拍干。200µL/孔加入封闭缓冲液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗板5次后拍干。610.3.2ELISA操作步骤10.3.2.1酶标板上对照和样品的分布图，见图1。在A1孔和B1孔加入Mh阳性对照血清各100μL，在C1孔和D1孔加入Mh阴性对照血清各100μL；剩余孔加入待检样品血清100μL，每孔两个平行，37℃孵育2h，洗板同上。10.3.2.2每孔加入100μL的酶标抗体，37℃孵育45min，洗板同上。10.3.2.3每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光孵育15min。10.3.2.4每孔加入50μL终止液终止显色反应，使用酶标仪测定450nm波长处的OD值。123456789APS3BPS3CNS4DNS4ES1S5FS1S5GS2S6HS2S6说明：P—阳性血清对照孔；N—阴性血清对照孔；S1、S2、S3、S4等—待检血清孔，以此类推。图1样品加样记录表（推荐模式）10.3.3试验成立条件阳性对照OD450＞1.5，且阴性对照OD450＜0.2，试验结果有效；否则，应重新进行试验。10.3.4结果判定在试验成立的前提下，待检样品OD450＞0.2，则判定该待检样品为Mh抗体阳性；待检样品OD450≤0.2，则判定该待检样品为Mh抗体阴性。11综合判定11.1经6.3判定为疑似Mh感染病例，经细菌分离培养（见第8章）分离出溶血性曼氏杆菌，或经PCR方法（见第9章）检测出Mh核酸的，可判为溶血性曼氏杆菌感染。11.2临床无明显特异症状的非免疫动物经间接ELISA方法（见第10章）检测出抗体阳性的，可判为该动物曾经疑似感染过Mh，需结合其他方法进行综合确诊。11.3临床无明显特异症状的牛、羊，经第8章、第9章、第10章中任意一项检测出阳性的，可判为溶血性曼氏杆菌感染（潜伏感染或持续感染）。7（规范性）试剂的配制A.1胰蛋白胨大豆肉汤胰蛋白胨大豆蛋白胨氯化钠磷酸氢二钾葡萄糖2.5gpH7.3±0.2准确称取胰蛋白胨大豆肉汤（TrypticSoyBroth,TSB）30g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，备用。A.20.01mol/LPBS溶液氯化钠氯化钾磷酸二氢钾磷酸氢二钠0.2g0.24g3.65gpH7.2将上述试剂加入到800mL蒸馏水中溶解，加水定容至1000mL，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，室温保存备用。A.3胰蛋白胨大豆琼脂胰蛋白胨大豆胨氯化钠琼脂5.0g5.0gpH7.3±0.2准确称取胰蛋白胨大豆琼脂（TrypticSoyAgar,TSA）40g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，充分混匀后倒平皿。A.4包被缓冲液（0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液）碳酸钠碳酸氢钠去离子水0.318g0.588g200mL用0.22μm滤膜过滤除菌，室温保存备用。A.5封闭缓冲液（含3%BSA的PBST）pH7.4PBS吐温-20BSA现配现用。A.6洗涤缓冲液—PBSTpH7.4PBS吐温-20现配现用。A.7稀释缓冲液（含1%BSA的PBST）pH7.4PBS吐温-20BSA现配现用。A.8TMB显色液1000mL0.5mL1000mL0.5mL1000mL0.5mLA.8.1底物液ATMB（分析纯）无水乙醇或DMSO蒸馏水A.8.2底物液B磷酸氢二钠（分析纯）柠檬酸（分析纯）0.75%过氧化氢尿素蒸馏水200mg加至1000