2.2动物细胞工程高二生物教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

动物细胞工程发展历程（含胚胎工程）希普：首例胚胎移植成功哈里森:首创动物组织体外培养法张明觉：发现哺乳动物精子获能现象格登、童第周：体细胞核移植成功试管家兔诞生米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术胚胎分割移植成功埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞克隆羊多莉诞生山中伸弥：获得诱导多能干细胞单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生我国科学家首次培育了体细胞克隆猴1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年第2节

动物细胞工程第2章细胞工程选修三动物细胞培养1动物细胞融合技术与单克隆抗体2目录动物体细胞核移植技术与克隆动物3习题检测41.阐明动物细胞培养的条件和过程。2.阐述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。一、学习目标二、重难点1.动物细胞培养的条件和过程。3.阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程，认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。2.干细胞在生物医学工程中的应用。3.单克隆抗体的制备和应用。4.用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。动物细胞工程动物细胞培养动物细胞融合动物细胞核移植——动物细胞工程的基础动物细胞培养1问题探讨在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增。目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。动物细胞培养1一、动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件营养物质其他条件<<糖类、氨基酸无机盐、维生素……无菌、无毒的环境适宜温度、pH和渗透压适宜的气体环境——充足的营养、稳定的内环境不同的细胞、组织适合生存的环境不同，需要配置不同的培养基。一、动物细胞培养的条件1.营养合成培养基+（1）合成培养基

将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基称为合成培养基。（2）血清等一些天然成分

由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。血清可以补充合成培养基中缺乏的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等。细胞培养时，一般需添加10%～20%的血清或血浆。一般使用液体培养基，也称为培养液。血清等一些天然成分血清

血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白质主要为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本原料，且有些氨基酸是动物细胞本身不能合成的（称为必需氨基酸），必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素等。血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，它们能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，在培养动物细胞时，为保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需在培养基中添加10%~20％的血清等天然成分。一、动物细胞培养的条件2.无菌、无毒的环境（1）无菌①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理②在无菌环境下进行操作③可根据实际情况适量添加抗生素（2）无毒

清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。④定期更换培养液3.温度、pH和渗透压一般与动物体内相同（1）适宜的温度：（2）适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为

。7.2-7.4（3）适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。（1）气体的组成及作用95%空气5%CO2（2）培养装置哺乳动物细胞培养的温度多以

为宜。36.5±0.5℃培养皿或松盖培养瓶CO2培养箱置于维持培养液的pH细胞代谢所必需4.气体环境一、动物细胞培养的条件动物细胞培养1体外培养的动物细胞可以分为两大类悬浮培养瓶第1类：悬浮生长细胞细胞能够悬浮在培养液中生长增殖第2类：贴壁生长细胞细胞需要贴附于某些基质(如培养瓶壁)表面才能增殖(主要类型)这些细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。接触抑制当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。动物细胞培养1思考：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少动物细胞培养1二、动物细胞培养的过程动物细胞培养是指从动物体中取出相关的

，将它们分散成

，然后在

下，让这些细胞

和

的技术。生长组织单个细胞适宜的培养条件增殖

动物细胞培养（1）原理：细胞增殖（2）目的：获得细胞或细胞产物传代培养取动物组织制成细胞悬液原代培养放入CO2培养箱中培养放入CO2培养箱中培养用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞转入培养液中进行二、动物细胞培养的过程机械方法胰蛋白酶处理胶原蛋白酶处理动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜条件在适宜条件分瓶培养传代培养（1）取材原因细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。1.取动物组织二、动物细胞培养的过程机械方法胰蛋白酶处理胶原蛋白酶处理动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜条件在适宜条件分瓶培养传代培养1.取动物组织（2）将组织分散成单个细胞①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；②能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。保证细胞

所需的营养物质的供应及有害产物的及时排出。二、动物细胞培养的过程原因将组织分散成单个细胞培养的原因

动物细胞培养时，需将相关的组织分散成单个细胞培养，因为将组织块分散成单个细胞后，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而且用大块组织进行培养时，组织块内部细胞的营养供应和代谢废物排出都比较困难，且细胞相互接触，限制了细胞的生长和增殖。同时，分散成单个细胞培养，也可使在细胞水平上操作的其他技术得以实现。习题巩固1.常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？

用胃蛋白酶行吗？说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。2.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗，为什么？

细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶会把细胞消化掉。因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。二、动物细胞培养的过程机械方法胰蛋白酶处理胶原蛋白酶处理动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液放入培养瓶在适宜条件在适宜条件分瓶培养传代培养原代培养（2）用培养液将细胞制成细胞悬液，再将

细胞悬液放入培养皿或培养瓶。培养瓶或培养皿要求：内表面光滑、无毒、易于贴附。二、动物细胞培养的过程机械方法胰蛋白酶处理胶原蛋白酶处理动物组织块分散成单个细胞加培养液放入培养瓶在适宜条件在适宜条件分瓶培养传代培养原代培养3.原代培养将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养称为原代培养。细胞悬液机械方法胰蛋白酶处理胶原蛋白酶处理动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液放入培养瓶在适宜条件在适宜条件分瓶培养传代培养悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大有害代谢物积累培养中营养物质缺乏接触抑制细胞分裂受阻需要二、动物细胞培养的过程原代培养4.传代培养将分瓶后的细胞培养称为传代培养。习题巩固3.进行传代培养(分瓶培养)时，如何处理？悬浮细胞贴壁细胞离心法收集胰蛋白酶处理制成细胞悬液分瓶培养思考：正常细胞能否一直传代培养下去？传代培养传代培养部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止大部分细胞衰老死亡少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展。10~50代继续培养（50代以后）（有限细胞系）（无限细胞系）使用或冷冻保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)。这一阶段的细胞称为细胞株无限细胞系的遗传物质一定改变区分原代培养和传代培养

区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象①第一次用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养。②第二次用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，分瓶后

的细胞培养为传代培养。习题巩固3.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更容易培养？为什么？细胞增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物细胞比老龄动物细胞易于培养。分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。4.动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养过程培养结果培养目的植物细胞的全能性细胞增殖固体液体植物激素动物血清脱分化、再分化原代培养、传代培养可获得植物体动物细胞群快速繁殖植物得到动物细胞及细胞产物相同点：培养基中都需要加入营养物质、培养过程中都需要防止杂菌污染、都需要提供适宜的温度、pH和渗透压的条件。传代培养取动物组织制成细胞悬液原代培养放入CO2培养箱中培养放入CO2培养箱中培养用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞转入培养液中进行二、动物细胞培养的过程习题巩固5.(2023·山东德州期末)如图所示为动物细胞培养的基本过程，下列关于甲、乙、丙、丁四个操作过程的叙述，正确的是(

)A.甲过程可选取动物个体的任何组织细胞B.乙过程可用纤维素酶和果胶酶处理细胞C.丙过程所用培养液中需添加动物血清D.丁过程中的细胞因接触抑制而大量死亡C习题巩固6.(2023海南,7,3)某团队通过多代细胞培养，将小鼠胚胎干细胞的Y染色体去除，获得XO胚胎干细胞，再经过一系列处理，使之转变为有功能的卵母细胞。下列有关叙述错误的是(

)A.营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制B.获得XO胚胎干细胞的过程发生了染色体数目变异C.XO胚胎干细胞转变为有功能的卵母细胞的过程发生了细胞分化D.若某濒危哺乳动物仅存雄性个体,

可用该法获得有功能的卵母细胞用于繁育A

习题巩固7.(2022江苏,14,2)航天员叶光富和王亚平在天宫课堂上展示了培养的心肌细胞跳动的视频。下列相关叙述正确的是(

)A.培养心肌细胞的器具和试剂都要先进行高压蒸汽灭菌B.培养心肌细胞的时候既需要氧气也需要二氧化碳C.心肌细胞在培养容器中通过有丝分裂不断增殖D.心肌细胞在神经细胞发出的神经冲动的支配下跳动B

动物细胞培养1三、干细胞的培养及其应用干细胞早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。胚胎干细胞成体干细胞定义分布种类动物细胞培养1三、干细胞的培养及其应用1.胚胎干细胞（1）分布（2）特点（3）应用实例（4）局限性早期胚胎中具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等。需要分化诱导因子诱导必须从胚胎中获取，涉及伦理问题，因而限制了在医学上的应用。动物细胞培养1三、干细胞的培养及其应用2.成体干细胞（1）分布（2）举例（3）特点成体组织或器官内造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）神经干细胞（神经系统中）精原干细胞（睾丸中）发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例

具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。2.成体干细胞（4）应用

有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。①应用原理②应用实例

治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）。

治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。Ⅰ.造血干细胞Ⅱ.神经干细胞治疗细胞损伤造成的疾病动物细胞培养1四、诱导多能干细胞及其应用1.概念通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞。2.制备方法（1）将特定基因或特定蛋白导入细胞；

（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）（2）用小分子化合物诱导形成。3.优点（1）诱导过程无须破坏胚胎；（2）iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，

理论上可以避免免疫排斥反应。四、诱导多能干细胞及其应用4.应用移植取成纤维细胞等iPS细胞转入相关因子细胞发生转化分化胰岛细胞神经元血细胞肠上皮细胞心肌细胞肝细胞病人iPS细胞用于治疗人类疾病示意图取成纤维细胞转入相关因子细胞转化为iPS细胞诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞移植回病人体内课堂小结无菌、无毒营养温度、pH和渗透压气体环境制备细胞悬液原代培养传代培养动物细胞培养动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程干细胞的培养和应用干细胞的种类、特点及应用iPS细胞的培养和应用干细胞应用面临的问题存在存在着导致肿瘤发生的风险。习题巩固1.利用iPS细胞治疗镰状细胞贫血的过程是首先制备患者的iPS细胞，

再将其诱导形成造血干细胞，最终输给患者使其产生健康的血细胞。

判断该过程是否能治疗镰状细胞贫血？并阐述理由。

不能。

因为患者体细胞的相应基因是突变的，制成iPS细胞仍然是突变的，分化成的细胞也是突变的，因此无法通过该方法治疗。习题巩固8.胚胎干细胞必须从胚胎中获取，但这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。科学家通过体外诱导成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞(简称iPS细胞)。因为诱导过程无须破坏胚胎，而且iPS细胞可来源于病人自身的体细胞，因此iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。如图为iPS细胞的获得及用其培育不同种细胞的示意图(c－Myc、Klf4、Sox2和Oct3/4等基因与细胞的脱分化有关)。回答下列问题：习题巩固(1)在对成纤维细胞进行培养时，常用胰蛋白酶处理使之分散成单个细胞，这说明细胞间的物质为_______，_____(填“能”或“不能”)用胃蛋白酶处理成纤维细胞，原因是：蛋白质不能

多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中失活变性。(2)在培养iPS细胞的过程中，培养基中应含有细胞所需的各种营养

物质，并定期更换培养液。定期更换培养液的目的是：清除代谢物﹐防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。习题巩固(3)过程③④为iPS细胞提供的条件不同，分化得到的细胞不同，可知细胞分化是_______________的结果。若iPS细胞来源于病人自身体细胞的诱导，再将其分化出的细胞移入患者体内的优势是___________________。(4)如果诱导iPS细胞定向分化为原始生殖细胞，

该技术可能的应用是_____________。基因选择性表达解决不育问题避免了免疫排斥问题习题巩固9.(2023汕头一模,12)通过大量实验，在多种候选基因中筛选出Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc(简称SKOM)4种基因。将这些基因导入高度分化的体细胞，可使其重编程，形成类似胚胎干细胞(ES细胞)的一种细胞类型，称为iPS细胞。下列说法正确的是(

)A.不同类型的干细胞分裂和分化潜能基本相同B.胚胎干细胞因需要从胚胎中获取涉及伦理问题而限制了其应用C.诱导产生iPS细胞的过程中需用到基因工程技术和核移植技术D.iPS细胞和ES细胞具有相同的基因组成且都能体现出细胞的全能性B

习题巩固10.(2023广州二模,10）骨髓间充质干细胞(BMSC)在某些诱导剂作用下可分化成心肌细胞，在心脏类疾病的治疗中拥有广阔的应用前景。在细胞培养的过程中，通过检测细胞中基因的表达产物可以判断细胞的分化方向。科研人员研究丹酚酸B(丹参提取物)对BMSC分化的影响，从大鼠体内分离BMSC并进行多代培养，用一定浓度的丹酚酸B处理一段时间后，与对照组相比,实验组中与分化为心肌细胞相关的关键基因的mRNA含量明显增加。下列叙述错误的是(

)A.在使用丹酚酸B和生理盐水处理细胞前，需对两种试剂进行灭菌处理B.原代培养的BMSC出现接触抑制时，需要用胃蛋白酶处理并进行分瓶培养C.BMSC与多能干细胞都是具有分裂能力的细胞，且具有一定的分化潜能D.推测丹酚酸B是通过促进相关基因的转录来促进BMSC分化为心肌细胞的B

习题巩固11.(2023·河北石家庄期中)美国和日本的两个研究小组分别宣布，其研究人员成功地将人体皮肤细胞改造成了几乎可以和胚胎干细胞相媲美的诱导多能干细胞——iPS细胞，人类“iPS细胞”可以形成神经元等人体多种组织细胞。以下有关“iPS细胞”的说法正确的是(

)A.“iPS细胞”分化为人体多种组织细胞的过程体现了细胞的全能性B.“iPS细胞”既可分化形成神经元，也可用于分化形成心肌细胞，

说明“iPS细胞”在分裂时很容易发生突变C.“iPS细胞”有细胞周期，它分化形成的神经细胞没有细胞周期D.“iPS细胞”只能分化成人体多种组织细胞，

是因为它不具有人体细胞的全部遗传物质C习题检测1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。（1）培养环境中需要O2，不需要CO2。（

）（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（

）（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和

动物血清（

）（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续

增殖（

）×√××习题检测2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是()A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞B.造血干细胞可以分化为各种血细胞C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用A习题检测3.现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施?

像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(HumanLeukocyteAntigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。习题检测（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，

该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。A细胞B细胞A原生质体B原生质体正在融合的原生质体杂种细胞愈伤组织杂种植株移栽后的植株①①②③④⑤⑥①去除细胞壁纤维素酶去壁：酶解法果胶酶②诱导融合物理法：化学法电融合法、离心法聚乙二醇（PEG）融合法高Ca2+

-高pH融合法等③细胞壁再生④脱分化⑤再分化⑥移栽植物细胞融合植物组织培养植物细胞的全能性细胞膜的流动性植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术

运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？动物细胞融合技术动物细胞融合技术与单克隆抗体2动物细胞融合技术与单克隆抗体2一、动物细胞融合技术1.概念

动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞形成一个细胞的过程。2.结果形成的具有原来

的

细胞，称为

。单核两个或多个细胞遗传信息杂交细胞3.原理细胞膜的流动性一、动物细胞融合技术4.动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法相同（1）物理方法：动物细胞没有细胞壁，可以直接诱导融合。电融合法、离心法（2）化学方法：聚乙二醇（PEG）法（3）生物方法：灭活病毒诱导法灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，并不破坏它们的抗原结构。——动物细胞融合特有一、动物细胞融合技术思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。肺结核病人病理切片原理是什么？4.动物细胞融合的方法——灭活病毒诱导法原理

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。一、动物细胞融合技术5.构建动物细胞融合模型①融合过程:细胞膜融合→细胞质融合→________融合。②重组细胞的特点:具有____________________,杂种细胞表现出两个____________的特点。③融合后的杂交细胞经过__________后仍能形成两个完整的杂交细胞。动物细胞A动物细胞B膜融合、质融合动物细胞培养杂交细胞（单核）物理、化学、生物法诱导细胞核亲本细胞有丝分裂两种细胞的遗传信息动物细胞融合实质及完成的标志6.意义突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。7.应用一、动物细胞融合技术动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；PEG融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能动物细胞融合技术与单克隆抗体2二、单克隆抗体及其应用1.早期获得抗体的方法产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏反复注射动物体内抗原多种浆细胞多种抗体（血清）

每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体体内产生的特异性抗体多达百万种缺点二、单克隆抗体及其应用

动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性抗体种类可以达到百万种以上，但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的淋巴细胞，形成细胞群。遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。一个B淋巴细胞B淋巴细胞群单克隆抗体克隆产生单个B淋巴细胞寿命有限，又因为能产生抗体的B淋巴细胞属于高度分化的细胞，不可能无限增殖。1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞就能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。在体外培养条件下，如何让一个B淋巴细胞无限增殖？二、单克隆抗体及其应用动物细胞融合技术与单克隆抗体2二、单克隆抗体及其应用2.单克隆抗体一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合杂交瘤细胞产生足够数量的特定抗体大量增殖单克隆抗体既能迅速大量增殖，又能产生抗体由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。（1）

概念2.单克隆抗体（2）

制备过程用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合诱导融合B、瘤、BB、B瘤、瘤瘤*不是为了得到抗体！√抗原免疫动物多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞（2）

制备过程用特定的

进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。B、瘤、BB、B瘤、瘤瘤选择培养基既能迅速大量增殖，又能产生抗体。杂交瘤细胞HAT培养基小资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。②鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能无限增殖。①人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能无限增殖。HAT培养基：在培养液中加入氨基嘌呤，阻断D途径B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能合成DNA，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长（2）

制备过程

对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞抗体检测★原理：抗原-抗体特异性结合将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养（克隆化培养）用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）AB1、AB2、AB3……（2）

制备过程注射到小鼠腹腔内体外培养将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。细胞培养液提取小鼠腹水中提取（2）

制备过程抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞单克隆抗体2.单克隆抗体单克隆抗体筛选二杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养筛选一骨髓瘤细胞

诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术既能大量繁殖又能产生专一抗体特异性强灵敏度高可大量制备注射抗原原理：细胞增殖原理：细胞膜具有流动性单克隆抗体制备过程中两次筛选的方法及目的项目第一次筛选第二次筛选（需要多次筛选）筛选原因方法筛选结果诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合细胞等用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。筛选出融合的杂种细胞选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞体内培养及体外培养的比较项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等）；操作简单；成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高2.单克隆抗体动物细胞融合技术与单克隆抗体2二、单克隆抗体及其应用3.单克隆抗体的应用资料1

用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。3.单克隆抗体的应用（1）作为诊断试剂(最广泛的用途)

女性怀孕后会分泌一种糖蛋白——人绒毛膜促性腺激素（HCG），尿液中会检出HCG的存在。

用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。动物细胞融合技术与单克隆抗体2二、单克隆抗体及其应用3.单克隆抗体的应用资料2

使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drugconjugate，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。单克隆抗体接头（连接体）连接抗体和药物，在肿瘤细胞内释放药物药物释放后杀死肿瘤细胞，如细胞毒素3.单克隆抗体的应用（2）用于疾病的治疗和运载药物(主要用于癌症的治疗)单克隆抗体+接头+药物=ADC①传递ADC释放到血液中②结合ADC与肿瘤抗原结合③内吞ADC通过受体介导的内吞作用进入细胞④循环部分ADCs在早期胞内体中与FcRn受体结合并被运出细胞网格蛋白溶酶体含有蛋白酶细胞凋亡⑤释放溶酶体与晚期胞内体融合，释放活性细胞毒素Ⅰ.单克隆抗体：①特异性强、灵敏度高★原理不损伤正常细胞，减少剂量。导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置。Ⅱ.抗癌药物：杀死癌细胞②疗效高、毒副作用小单克隆抗体+接头+药物=ADCADC的抗体和药物各具有什么作用？讨论1习题巩固抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。习题巩固可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？讨论2习题巩固单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？讨论3单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。习题巩固1.核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径(如下图)。正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。关于筛选原理的叙述，正确的是()A.免疫B细胞及其互相融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖B.骨髓瘤细胞及其互相融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖C.杂交瘤细胞因为可以进行上述两个途径所以能在HAT培养基上大量增殖D.HAT培养基上筛选出的所有杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度目标抗体B习题巩固2.

(2023·黑龙江黑河市一模)人乳头瘤病毒(HPV)是一种DNA病毒，可诱发细胞癌变。抗HPV的单克隆抗体可以准确检测出HPV，从而及时监控宫颈癌的发生。以HPV衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体的过程如下图所示。下列叙述错误的是（

）A.在HAT培养基上存活的杂交瘤细胞

既能无限增殖又可以分泌抗体B.单克隆抗体的特点是灵敏度高、

特异性强，可以大量制备C.可用HPV衣壳蛋白检测筛选出能

产生特异性抗体的杂交瘤细胞D.单克隆抗体制备过程涉及的生物学

原理有细胞增殖和细胞膜的选择透过性D习题巩固3.(2022山东,15,2分)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是()A.双抗可同时与2种抗原结合B.利用双抗可以将蛋白类药物

运送至靶细胞C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞D习题巩固4.(2023东莞质检,12)病毒A常导致西瓜、甜瓜等多种瓜类发病或减产，如图示科研人员制备抗病毒A单克隆抗体的部分过程，有关叙述错误的是(

)A.以提纯的病毒A作为抗原

对小鼠甲进行免疫B.单细胞悬液可由小鼠甲的

脾脏用解离液分散成单个

细胞制得C.制备过程中筛选1和筛选2的原理和目的均不相同D.制备成功的单克隆抗体可用于检测田间西瓜是否感染病毒AB习题巩固5.(2023广州一模，6)双特异性抗体(BsAb)是一种能够同时结合两种抗原的抗体。CD19和CD47是淋巴瘤细胞广泛表达的表面标记物(CD19在B细胞表面普遍存在，CD47在正常组织细胞上普遍存在)。研究人员将两种产生不同抗体的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞，最终得到了能同时结合CD19和CD47的BsAb，它可以结合同一靶细胞上两种不同的抗原，通过这种“双靶向”模式增强对肿瘤细胞的选择性，在体内、体外实验中均可显著杀伤淋巴瘤细胞。下列叙述错误的是(

)A.同时注射2种抗原后提取B细胞，易得大量同时分泌两种抗体的浆细胞B.获得BsAb的过程中，筛选双杂交瘤细胞的依据是抗原—抗体的特异性结合C.使用BsAb治疗对正常细胞的损伤小于联合使用CD19单抗和CD47单抗D.若BsAb的部分结构发生改变，可能会出现治疗效果降低的情况A习题巩固6.(2023·北京延庆区模拟)抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列表述正确的是(

)CA.ADC可通过主动运输

进入肿瘤细胞B.抗体进入细胞后激活溶酶体酶，

导致细胞凋亡C.单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合D.肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，所以不会产生新的蛋白质习题巩固7.(2022·东北三省联考)科学家将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，制成了抗体—药物偶联(ADC)，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，机理见图。回答下列问题：(4)除ADC外，单克隆抗体在临床上的应用还有

(答出两点即可)。习题巩固(1)制备单克隆抗体时，获得的杂交瘤细胞需进行________培养和抗体检测，抗体检测的原理是________________________。(2)ADC中，抗体的作用是

___________________________________________。除细胞毒素外，图中的物质C还可以

。（答出两点即可)(3)图中细胞A为

，结构B为一种细胞器，在细胞A中

的作用是________________________。克隆化抗体与抗原特异性结合与肿瘤细胞特异性结合，将物质C带到肿瘤细胞放射性同位素、化学药物肿瘤细胞水解抗体，释放出物质C作为诊断试剂；单独使用治疗疾病习题检测下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，

错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株C习题检测2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，

经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体A习题检测3.假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。课堂小结两个过程动物细胞融合过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法——灭活病毒一个新细胞——杂交瘤细胞一个优势——单克隆抗体特异性强、灵敏度高、

可大量制备的优势课堂小结动物体细胞核移植技术与克隆动物3问题探讨“（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声‘变！’，即变作三二百个小猴，周围攒簇（cù）。”这是《西游记》中的一段描述，展示了中华先贤的想象力。毫毛来自体细胞，我们能用体细胞“变”出猴来吗？

2017年，中国的科学家将这一幕变成了现实，他们利用体细胞核移植技术成功克隆出两只猕猴“中中”和“华华”（如右图)。克隆技术为何不称为“克隆技术”而是“核移植技术”？克隆（Clone）技术

在生物学上包含分子、细胞、个体3个层次，即分子克隆、细胞克隆、个体克隆。是一个很广的概念，凡指新形成的事、物与亲本一致的现象均可称为“克隆”。单克隆抗体技术、PCR技术动物细胞培养技术植物细胞培养技术植物组织培养技术核移植技术问题探讨1.克隆猴的过程中最大的困难是什么？最大的困难是如何才能激发动物细胞表达其全能性。2.由于植物细胞具有全能性，所以可以直接利用其体细胞培育出克隆植物。可以直接利用动物细胞培育出克隆动物吗？

不能。因为动物细胞的全能性受到限制，不能经培养直接发育成完整个体，所以动物通过体细胞核移植技术得到克隆动物。动物体细胞核移植技术与克隆动物3一、动物细胞核移植技术1.概念将动物的一个细胞的

，移入

中，使这个重新组合的细胞发育成

，继而发育成

的技术。细胞核去核的卵母细胞新胚胎动物个体卵母细胞动物细胞去核取核移入重组细胞新胚胎克隆动物发育发育2.原理动物细胞核的全能性3.生殖方式无性生殖一、动物细胞核移植技术克隆动物不是核供体动物100%复制的原因是什么？①克隆动物的细胞质遗传物质来自受体卵母细胞的细胞质（或供体细胞和受体卵母细胞）。②生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境等因素的影响。③可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异。一、动物细胞核移植技术4.哺乳动物核移植分类种类难易程度原因相对容易十分困难胚胎细胞核移植体细胞核移植分化程度低，全能性容易表现分化程度高，全能性难表现动物细胞核的全能性整个细胞随分化程度的提高，分化潜能逐渐减弱，全能性受到限制。一、动物细胞核移植技术5.非人灵长类动物体细胞核移植的困难原因①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其

前

的功能状态，这导致了

；胚胎发育率低②对非人灵长类动物

进行操作的技术尚不完善。胚胎分化非人灵长类动物：具有许多与人类相似的生物学特征的灵长类动物。我国科学家经过多年努力，攻克了这些障碍，终于成功获得了体细胞克隆猴。动物体细胞核移植技术与克隆动物3二、体细胞核移植的过程从屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞(研究人员正在使用设备从牛的卵巢采集卵母细胞)，在体外培养到MⅡ期通过显微操作去核将供体细胞注射入去核的卵母细胞高产奶牛(供体)从供体高产奶牛身体的某一部位(如耳)上取体细胞，进行细胞培养通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚胎将胚胎移入受体(代孕)母牛体内出生与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛二、体细胞核移植的过程从屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞(研究人员正在使用设备从牛的卵巢采集卵母细胞)，在体外培养到MⅡ期。①卵母细胞体积大，易操作②卵黄多，营养物质丰富。1.为何选用卵母细胞？2.为何要培养到MⅡ期？含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件正常排出的卵子即处于MⅡ期二、体细胞核移植的过程高产奶牛(供体)

一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。从供体高产奶牛身体的某一部位(如耳)上取体细胞，进行细胞培养。二、体细胞核移植的过程实际上是去除纺锤体-染色体复合物1.卵母细胞去核的原因是什么？保证克隆动物的遗传物质最大限度来自优良供体。2.卵母细胞去核的方法？显微操作去核法梯度离心紫外光短时间照射化学物质处理使DNA变性失活，达到去核的目的。没有刺破卵母细胞膜，对卵母细胞伤害小。通过显微操作去核二、体细胞核移植的过程将供体细胞注射入去核的卵母细胞直接将供体细胞注入去核卵母细胞的透明带内将供体细胞整个注入去核卵母细胞中的原因①对卵母细胞损伤较小；②保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。二、体细胞核移植的过程通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚胎。重构胚胎：人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。二、体细胞核移植的过程用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚胎，使其完成细胞分裂和发育进程。二、体细胞核移植的过程将胚胎移入受体(代孕)母牛体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛新生个体的细胞质基因一部分来自去核卵母细胞，一般分来自供体细胞。二、体细胞核移植的过程细胞培养MII期去核细胞融合激活重构胚取供体细胞采集卵母细胞供体细胞去核卵母细胞重构胚胎早期胚胎将胚胎移入受体（代孕）母牛体内将供体细胞注入去核的卵母细胞生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛动物细胞培养动物细胞核移植早期胚胎培养胚胎移植习题巩固1.体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相比，有什么相似或不同之处？

请你预测它们应用前景的差异。利用体细胞核移植技术和诱导iPS细胞都能生成干细胞，但它们的过程是完全不同的。①通过体细胞核移植技术可以生成带有核供体细胞遗传物质的

胚胎干细胞；诱导iPS细胞需要在细胞中表达几个关键基因，

将细胞逆转到类似胚胎干细胞的状态。习题巩固②体细胞核移植技术对核供体细胞有较高要求，一般情况下体细胞的分化程度越高，它重编程为干细胞的成功率就越低；可

诱导成为iPS细胞的细胞来源相对广一些，研究表明成纤维细胞、B淋巴细胞、脂肪干细胞等都可以诱导成为iPS细胞。③体细胞核移植技术涉及采集卵母细胞、去核、融合等复杂的操作；诱导iPS细胞的技术流程相对简单，可能更适合用于生产实践。目前科学家还在研究由这两种技术生成的干细胞在基因表达、DNA甲基化等方面的差异，这些研究成果也将直接影响它们今后的应用。动物体细胞核移植技术与克隆动物3三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题1.应用前景加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育（1）在畜牧生产中（2）在医药卫生领域①建立转基因体细胞系，再利用此技术培育的转基因克隆动物可作为生物反应器生产珍贵的医用蛋白。②治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官，可作为异种移植的供体。③患者的核移植胚胎干细胞经过诱导分化，能形成相应的细胞、组织或器官可用于移植以避免免疫排斥反应。治疗性克隆1.应用前景治疗性克隆与iPS细胞治疗病人取核去核卵母细胞重构胚胎各种细胞组织或器官诱导取出体细胞核移植移植成纤维细胞取出转入相关因子各种细胞组织或器官iPS细胞取出胚胎干细胞诱导移植治疗性克隆iPS细胞治疗细胞发生转化（3）在科研领域①研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来

分析致病基因；③克隆特定疾病模型的动物，还能为

研究该疾病的致病机制和开发相应

的药物提供帮助。1.应用前景（4）在保护濒危物种方面该技术有望增加濒危物种的存活数量黑草黄弄蝶白鳍豚金丝猴1.应用前景动物体细胞核移植技术与克隆动物3三、体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题2.存在问题（1）该技术的成功率非常低，各个技术环节有待进一步改进。（2）