人教版高中生物必修三《DNA片段的扩增及电泳鉴定》教学设计

人教版高中生物必修三《DNA片段的扩增及电泳鉴定》教学设计

一、教材分析

本节是人民教育出版社普通高中《生物学选择性必修3生物技术与工程》第3章第2节，

探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定，适用于高二年级学生学习。2017版《高中生物学课程

标准》中，要求学生“阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体

的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤”。建议开展“利

用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定”的实验活动。

学生已经学习了PCR反应的原理：利用引物与模板特异性结合，通过设计特异性引物可以

对特定的DNA片段进行扩增。生物大分子带负电，在电场中会迁移，在琼脂糖凝胶中迁移的速

度与分子量的大小成正相关，所以可以将不同大小的DNA片段进行区分，再与标准DNA进行比

对，大致估测出待测DNA的片段长度。本实验有助于学生进一步理解PCR反应的原理，掌握

PCR和琼脂糖凝胶电泳技术，认同现代生物技术的应用价值，运用数学方法探究生物学问题，

提高核心素养。

二、教学目标

1.结合生物体中DNA复制过程以及生物大分子的特性说出PCR技术和电泳技术的基本原理,

进一步加深结构与功能密切联系的生命观念。

2.从引物与模板的特异性结合角度分析，得出利用PCR和电泳技术对未知DNA分子鉴定的

机理，培养科学思维。

3.在教师的引导下设计科学合理的实验流程（特别注意对照组设置的意义）并实施实验，

能够对实验结果进行准确分析并得出结论，体会并学会科学探究的一般过程。

4.积极关注社会热点问题，对相关消息作出理性解释和判断，培养社会责任。

三、教学过程

1.创设情境，导入新课

2009年，河南省文物考古研究院对位于河南省安阳市西高穴村南部的被盗东汉大墓进行

了抢救性发掘，该墓葬随后被确认为魏武帝曹操之陵墓，即高陵。在曹操墓的发掘过程中，考

古人员共在高陵陵园内发现三具遗骸。其中，两具遗骸比较完整，判定一具为60岁左右男性，

一具为老年女性。但另一具遗骸非常不完整，性别仍有待认定。

2.提出问题，展开探究

假设你是考古人员，请问可用什么方法确定该遗骸的性别？

材料一、人类的性别决定

人类的性别是由性染色体所决定的，女性的性染色体是XX型，男性的性染色体是XY型。Y染

色体上含有发育为男性的特殊基因，例如DYZ1基因，位于人类Y染色体上，其特异序列长度

154bpo具体碱基序列如下：

5'^GTTGCTGGCGCCTCCACTTTATTCCAGGCCTGTCCGAGGCCCCAAGAGTGCGfiCCGCAASCTTGTGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGC

|山仔…I…”+，，卜•“，W++，，“，…+卜，，“+，，”+—，+•一卜，“•，|-“|，，+•”，，•"+“"+，，"卜

3'CAACGACCGCGGAG6TGAAATAAGGTCCGGACAGGCTCCGGGGTTCTCACGCCGGCGTTCGAACACCCCAATACGATCAATAACGAGTCG

GGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGGATCTCAGCCATTCGTTCCCATTCCATTTCAATCGCGGCGATT31

-，+一中—“叶,““"叶『++"+”，+一叶―—+—讣—*卜,+中|

CCACCGTCGTCGGTTGAGTCGAAGGAAAGCCCGAAACAATCGTCCTAGAGTCGGTAAGCAAGGGTAAGGTAAAGTTAGCfiCCGCTAA^5'

检测样本中是否含有154bp的DYZ1基因？如何观察DNA中是否含有DYZ1基因？

要观察到某一特定大小的DNA片段，例如前面提到的长度为154bp的DYZ1基因，可以利

用琼脂糖凝胶电泳的办法，将其鉴定出来。DNA分子在电泳液中带负电荷，在电场中向正极移

动。琼脂糖凝胶具有网络结构，DNA分子通过时会受到阻力。DNA片段越大，受到的阻力也越

大，因此在凝胶电泳中迁移较慢。经过一段时间电泳后，不同大小的DNA片段就区分开来，形

成不同的条带。

标&DMAM

lOOObp

SOObp

400bp

300bp

200bp

lOObp

电泳后,大量DNA片段通过特异性的核酸染料染色，我们就可以清楚的看到DNA电泳条带。

例如，在标准DNA分子电泳后有大小依次为lOObp,200bp,300bp,400bp,500bp等条带，通

过与标准DNA对比，比如在一号泳道出现在lOOObp的位置出现了条带，说明样本中有大量的

lOOObp大小的DNA,2号泳道出现两条条带，说明样本中有两种DNA片段。我们要检测的DYZ1

基因大小为154bp,其条带应位于100-200之间的位置。

老师提问：一个DNA分子进行电泳能观察到条带吗？

答：不能，我们观察到的DNA条带是成千上万个相同DNA分子经过电泳后而形成的。

老师总结：DNA电泳可以检测出目标DNA,但前提是要获得大量的长度为154bp的DYZ1基因的

DNA片段。那我们从样本中只能提取到极少量的DNA,远达不到检测的要求，怎么办？如何从

微量DNA中获得大量的DYZ1基因片段?

PCR技术可以实现从微量DNA中大量获得某一特定的DNA片段。聚合酶链式反应（简称PCR）

是一种用于复制、扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA

复制。PCR的最大特点是能在短时间内将微量的DNA大幅扩增。我们都知道，在体内DNA作为

遗传为物质是可以复制的，PCR技术其实就是实现了DNA在体外条件的复制。在体内，DNA聚

合酶可以以四种脱氧核甘酸为原料，以DNA两条链为模板，合成新的DNA分子。DNA聚合酶起

始DNA的复制需要以一段15-30个碱基的单链RNA作为聚合酶作用的起点，我们把这一小段

RNA叫做引物。引物与DNA单链结合，然后招募DNA聚合酶完成DNA的复制。DNA复制完成后

再将RNA引物切除，补上DNA。根据DNA复制的原理，我们只需要在试管加入DNA模板，DNA

聚合酶，以及适当的引物就可以实现DNA的体外复制。两种引物分别作为复制的起始位点，保

证了扩增出来的DNA就是引物之间的DNA片段。

PCR的原理

引物1DNA聚合酶

一」.....*

DNA聚合酶"物2

..............特定DNA片段

根据前面的分析，要利用PCR技术复制DYZ1基因，那么，首先要在人类基因组数据库中

查阅了DYZ1的基因序列，如图，红色框内的DNA即为要复制的DNA片段。我们设计了上、下

游的两种引物，并送到生物公司合成好了。所以，理论上只要在试管中加入模板DNA、DNA聚

合酶、四种脱氧核甘酸，上、下游引物就可以实现DNA的体外扩增。

引物的设计

上游引物5,TCC<TnATTCCAGGCCrcTCC3,

下游引物5'TTGAAATCGAATGGGAAOGAATCG3,

3.配制反应体系，进行PCR

我们使用的PCR试剂叫做2XPCRmix,在这个试剂里面含有DNA聚合酶，四种脱氧核甘

酸，以及酶发挥作用的缓冲液等，我们只需要加入DNA模板，引物就可以进行PCR反应了。

2XPCRmix使用说明书

产品简介：2XPCRMix中含有耐高温的DNA聚合酶，dNTP,PCR反应所需的缓冲液等,

只需加入适量引物、模板和水即可进行PCR扩增。

使用说明：按下表的量混匀PCR反应所需的各种溶液：

试剂最终浓度体积体积

水—7uI3.4uI

10pg-

模板DNA10RI5uI

1ug*

引物1(10HM)0.8RM4uI1.6uI

引物2(10HM)0.8RM4uI1.6uI

2XPCRMix1X25yI10uI

总体积-50uI20u1

注意事项：由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用时请注意避

免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污

染。

本实验使用的PCR反应体系

2XPCRmix

25uL

（含甑四种脱轨核仔酸，缓冲液等）

上游引物（10umol/L）4nL

下游引物（10umol/L）4uL

模板DNA10uL

H2O7uL

共：50uL

如果要鉴定某DNA样本是来自男性还是女性，我们只要以这个DNA作为模板，进行PCR,

如果能产生大量的DYZ1片段，这说明样本DNA模板中含有DYZ1基因，是男性，反之为女性。

为了使实验更具说服力，我们还设计了几组对照。加入水的空白对照组，加入男性DNA的阳性

对照组，加入女性DNA的阴性对照组。

配制PCR反应体系:

g组别1234

7ul7ul7ul7ul

H2O

上游引物4ul4ul4ul4ul

下游引物4ul4ul4ul4ul

2Xlaq

25ul25ul25ul25ul

酶mix

样品DNA男性DNA女性DNA无菌水

模板

lOullOullOullOul

性

性

阳

阴空白

照

照

对

实验组对

对照

接下来，我们来制备阳性对照组和阴性对照组的DNA模板。由于PCR反应非常灵敏，只需

要极少量模板DNA就可以了。所以我们只需要按以下方法提出少量口腔上皮细胞的DNA就行了。

那么我需要一男一女两位同学来提供口腔上皮细胞，有志愿的吗？模板已经制备好了，接下来

我们来配置PCR反应体系。

口腔上皮细胞DNA粗提取液（模板）的制备：取材前，用凉开水漱净，去除口腔内的食物

残渣；用无菌的牙签在口腔两侧颊部轻轻刮动数次，获得口腔上皮细胞；将牙签放入300ul

裂解液中，反复搅动几次，将细胞洗下，即可。

在课前，我们已经把上面的四种物质加好了，所以只需要在每组溶液中加入10微升模板

就可以了。第一组加入未知样本DNA,第二组……PCR反应溶液配好以后放入PCR仪就可以实

现体外的DNA扩增了。启动PCR仪，它将按程序来进行反应。首先看PCR仪器的反应程序：主

要是三步温度变化：94℃,30s,称为变性；55℃,30s,称为退火；72℃,30s,称为延伸。

每一步的目的是什么呢？

PCR的过程

1、变性

目的其国5IUIIUUIIUIUIUIUIIUUIIUUIIIUU3，

目口,至四3,11111皿111］皿皿皿11皿1皿皿5.

94℃

snnnnnnnnnnnnnn‘

3.muniuinMminuimiiiN

变性：加热使DNA氢键断裂，DNA双链解聚为单链。

2、退火

.nnnnnnnnnnnnnn?

3,iiiiKiiiiJuiiniirim5,

-55℃

IUIIUUIIUIUIUIUIIUUIIUUIIIUU

3niwiiiiiiiiiiiiniiiinfliiiiii6

退火：降低温度，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

3、延伸

叫卜5IJ哂IIUIIIU—IIIIIUIIIUHU也MIIIU叫3।MinR|n

.，miiTuuni叫unminmni口

72℃

s,IIJJUIlllllllllIllUlIllJlIUUIIIDll3,

-HnniiiiiniiiiiiiinfiiiDniiinii..

5lUIIUIIIUIIIIIUIIIUIIH_,