竹荪不同部位抑菌效果的研究

摘要本文主要针对长裙竹荪的菌裙、菌柄、菌盖、菌托等各不同部位的乙酸乙酯提取物进行了抑菌方面的研究。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为实验菌株，通过平板打孔法，以抑菌圈直径为测量指标，对抑菌效果进行评价；采用连续倍比浓度稀释法来确定竹荪不同部位提取物的最低抑菌浓度（MIC值），比较四个部位的抑菌效果。结果如下：（1）长裙竹荪菌柄提取物的抑菌效果是四个部位中最好的，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的MIC值都是25mg/ml，且对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好；（2）长裙竹荪菌裙的提取物对大肠杆菌的抑菌效果最好，MIC值是50mg/ml；（3）长裙竹荪菌盖的提取物对沙门氏菌的抑菌效果最好，MIC值是25mg/ml；（4）长裙竹荪菌托的提取物对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌抑菌效果比较好，MIC值都是50mg/ml。关键词：长裙竹荪；乙酸乙酯提取物；抑菌圈直径；最低抑菌浓度AbstractIn

this

paper,

the

antibacterial

activities

of

ethyl

acetate

extracts

from

different

parts

of

Dictyophora

indusiata

such

as

fungus

skirt,

fungus

stem,

fungus

cover

and

v-olva

were

studied.

Taking

Escherichia

coli,

staphylococcus

aureus

and

salmonella

as

experimental

strains,

the

bacteriostatic

effect

was

evaluated

by

the

plate

punching

m-ethod

and

the

diameter

of

bacteriostatic

circle

as

measurement

index.

The

minimum

inhibitory

concentration

(MIC)

of

extracts

from

different

parts

of

Dictyophora

indusi-ata

was

determined

by

continuous

multiple

dilution

method,

and

the

antibacterial

eff-ects

of

the

four

parts

were

compared.

The

results

are

as

follows:

(1)

The

antibacterial

effect

of

Dictyophora

indusiata

stipe

extract

is

the

best

among

the

four

parts,

MIC

va-lues

for

Escherichia

coli,

Staphylococcus

aureus

and

Salmonella

are

all

25mg/ml,

and

the

inhibitory

effect

on

Staphylococcus

aureus

is

the

best.(2)

The

extract

of

Dictyop-hora

indusiata

maxim

maxim

maxim

has

the

best

antibacterial

effect

on

Escherichia

coli,

MIC

value

is

50mg/ml；;

(3)

The

extract

of

Dictyophora

indusiata

cap

has

the

b-est

antibacterial

effect

on

Salmonella,

MIC

value

is

25

mg/mL;

(4)

The

extract

of

Dc-tyophora

indusiata

volva

has

good

antibacterial

effect

on

Staphylococcus

aureus

and

Salmonella,

MIC

values

are

50mg/ml.Keywords:Dictyophora

indusiata;

Ethyl

acetateextract;

Diameter

of

bacteriostatic

ci-rcle;

Minimum

inhibitory

concentratio－１２竹荪不同部位抑菌效果的研究1引言1.1竹荪简介竹荪是担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属真菌[1]，它被人们称作"雪裙仙子"、"山珍之花"、"菌中皇后"等[2]，是“四珍”(香菇、银耳、竹荪、猴头)之首，是名贵的药食两用菌之一。现有竹荪共有12种，我国主要有棘托竹荪、长裙竹荪、短裙竹荪、红托竹荪、朱红竹荪、皱盖竹荪、黄裙竹荪[3]，最常见且可供人体食用的竹荪共有4种：红托竹荪、棘托竹荪、长裙竹荪和短裙竹荪[4]。竹荪由四个部位组成：不可食用部分（菌盖、菌托），可食用部分子实体（菌裙、菌柄）。竹荪有特殊的防腐抑菌抗炎的作用[5]，如在夏季烹饪时加入竹荪可以保持较长时间不腐败变质，所以竹荪也被称为天然的“防馊防腐剂”。1.2竹荪抑菌效果的研究现状竹荪有特殊的防腐效果，是一种天然的微生物拮抗剂，许多研究结果都证明了这一点。杨威等[6]人的研究结果表明，用四种不同的提取方法提取的棘托竹荪提取液，结果该提取物对细菌、酵母菌和青霉菌都有比较显著的抑制作用。刘文波等[7]人的实验结果得出了棘托竹荪和长裙竹荪的各种提取物都有显著的抑制作用。谭敬军[8]在研究竹荪抑菌特性的实验结果中发现，8种受试菌都有明显被竹荪的提取液抑制的结果，竹荪的抑菌物质对高温也相对于比较稳定。众多研究者通过不同的手段对竹荪中的抑菌防腐物质等成分进行了提取，不仅研究出了各种提取工艺，还对提取工艺的各项条件进行优化，而且还对竹荪提取物的抑菌方面进行了初步的探究。宋飞飞等[9]人研究了不同溶剂的提取方法提取竹荪抑菌活性物质的研究，实验结果表明，甲醇对竹荪的提取率和抑菌活性是最好的，但甲醇溶液在提取竹荪的时候，提取物中所含杂质较多，而有效的抑菌活性成分并没有明显的增加。然而提取物中的杂质过多，不利于后续竹荪抑菌活性成分进一步分离和纯化，反而增加了后期研究抑菌机制的难度。所以选择次之的乙酸乙酯作为研究竹荪抑菌活性物质提取的溶剂最为合适。陈敬华等[10]人用正己烷来提取长裙竹荪中的抑菌物质，结果显示提取物只对细菌有显著的抑菌性，而对霉菌和酵母菌则无抑菌性。檀东飞等[11]人选用棘托竹荪为原料。用乙酸乙酯为提取溶剂，对竹荪进行浸提，并用提取物来进行抑菌实验。结果表明，棘托竹荪提取物对细菌、霉菌、酵母菌都有显著的抑菌效果。罗盛莲[12]等人选用棘托竹荪和长裙竹荪，对其竹荪的抑菌作用和化学成分进行研究。实验结果表明，长裙竹荪乙酸乙酯浸膏水溶液提取物对供试霉菌和酵母菌的抑菌效果不显著，但对供试细菌表现出显著的抑菌效果；而棘托竹荪乙酸乙酯浸膏水溶液提取物对各供试菌都有显著的抑菌效果。可见，在对竹荪提取物的抑菌效果研究中，选择合适的提取溶剂非常重要。1.3研究的目的及意义当前竹荪抑菌方面的研究主要集中在各种溶剂对竹荪各部位的提取和提取物对常见致腐菌抑菌方面的研究，而关于不同部位竹荪提取物的抑菌性研究还未见报道。且由于所选用竹荪的部位、品种和溶剂都各不相同，所以致使研究结果也各不相同。比如长裙竹荪子实体的溶剂提取物对细菌有抑菌效果，而对酵母菌和霉菌则无抑菌性。而棘托竹荪子实体的溶剂提取物对常见的细菌、霉菌、酵母菌等均有一定的抑制效果。因此更深入了解竹荪不同部位提取物的抑菌性就尤为重要。本文提出对长裙竹荪不同部位的乙酸乙酯提取物的抑菌性进行比较性研究，分析长裙竹荪各个部位提取物的抑菌性是否一致，哪个部位的抑菌性最好，分析长裙竹荪各部位乙酸乙酯提取物的最低抑菌浓度，研究结果可为竹荪中的抑菌物质开发成为安全、无毒无害、无副作用的新型天然防腐剂奠定了基本的理论基础和相关的数据。1.4研究内容本研究利用乙酸乙酯对长裙竹荪的菌柄、菌裙、菌盖、菌托四个部位进行提取，探讨不同部位乙酸乙酯提取物对供试菌的抑菌效果。主要研究内容如下：（1）长裙竹荪不同部位抑菌性的研究以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为实验菌种，以抑菌圈直径为测量指标，探讨竹荪各部位乙酸乙酯提取物是否具有抑菌性，并分析各部位抑菌效果的差异性。（2）长裙竹荪不同部位最低抑菌浓度的确定以上述三种供试菌为试验菌株，采用连续倍比浓度稀释法来确定竹荪不同部位提取物的最低抑菌浓度（MIC值），比较长裙竹荪四个部位的抑菌性。2材料与方法2.1实验材料及仪器2.1.1材料原料：长裙竹荪菌柄、菌裙、菌盖、菌托，采于福建南平，自制为干品备用。供试菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌，由宁德师范学院生命科学学院微生物实验室提供。2.1.2试剂表2-1主要实验试剂名称说明牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉制作培养基氯化钠、氢氧化钠、乙酸乙酯化学分析纯2.1.3仪器表2-2主要实验仪器名称型号生产公司电热恒温水槽DK-8D上海精宏实验设备有限公司多功能粉碎机700A永康市红太阳机电有限公司循环水式多用真空泵SHZ-D(Ⅲ）河南省予华仪器有限公司旋转蒸发仪N-1100上海爱朗仪器有限公司水浴锅SB-1100上海爱朗仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070A上海飞越实验仪器有限公司电热恒温培养箱DHP-9272A上海飞越实验仪器有限公司电子天平AE224上海舜宇恒平科学仪器有限公司2.2实验方法2.2.1长裙竹荪不同部位乙酸乙酯提取物的制备取适量的竹荪各部位分别放入多功能粉碎机中粉碎，过80目筛，备用。竹荪不同部位粉末和乙酸乙酯，按照料液比1；25[14]的比例放入干燥的具塞三角瓶中，于75℃水浴中超声提取3h，抽滤，将所得滤液减压浓缩至油膏状，转至通风橱挥干溶剂，置于４℃冰箱中保藏备用。2.2.2抑菌试验准备供试菌株及菌悬液准备在超净工作台中将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌三种实验菌种接入到已制作完成的试管斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱中连续培养24h，用经过杀菌处理的接种环从已经活化好的三种供试菌的试管斜面上挑取1环至装有20ml的液体培养基里，放入150r/min的摇床里，37℃摇床培养24h，制成菌悬液备用。用血球计数板在显微镜下观察计数，把菌悬液的浓度调整至含孢子量或菌体数量为106CFU/ml~107CFU/ml。（2）培养基的制备琼脂40g，氯化钠10g，蛋白胨20g,牛肉膏6g，蒸馏水2000ml。将除了琼脂之外的其他成分溶解于蒸馏水，然后加入15%的NaOH溶液约为2ml，校正pH值到7.2~7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装于锥形瓶或试管中，121℃高压灭菌15min。将灭菌过的培养基，冷却到50~60℃，在超净工作台进行无菌操作，把培养基倾注到已经经过灭菌的培养皿中，每皿培养皿倒入15~20ml，半开皿盖，通风半小时，温度过高易产生冷凝水。2.2.3长裙竹荪不同部位抑菌效果分析以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为试验菌株，以抑菌圈直径为测量指标，分析长裙竹荪菌柄、菌裙、菌盖、菌托四个部位乙酸乙酯提取物的抑菌性。利用方差分析和多重比较的方法，确定各部位抑菌效果的差异性。然后将长裙竹荪不同部位提取物浸膏，采用倍比稀释法进行不同浓度的稀释，以菌落生长情况为评价指标，确定长裙竹荪不同部位乙酸乙酯提取物的最低抑菌浓度（MIC值）。（1）抑菌圈直径的测定实验采用平板打孔法。分别吸取1ml的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌三种试验菌株菌悬液于培养皿中，倒入配置好的培养基，摇匀。半开皿盖，通风半小时后，用7mm的打孔器在含菌平板上打上五个孔。配置1g/ml的长裙竹荪不同部位乙酸乙酯提取物原液，向含菌平板上加入0.1ml，其中一孔种放入0.1ml的无菌水作为竹荪不同部位的空白对照，37℃的恒温培养24h。培养完成后，用十字交叉法测量竹荪各不同部位的抑菌圈直径，每组试验做三组重复实验，根据所测得的抑菌圈直径来分析长裙竹荪各部位提取物对三种供试菌的抑菌性及抑菌效果的差异性。（2）最低抑菌浓度（MIC值）的测定将长裙竹荪不同部位乙酸乙酯提取物浸膏进行系列稀释。以1g/ml作为原液，利用无菌水进行连续倍比稀释，配成浓度分别为100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.5625mg/ml等7个梯度的长裙竹荪乙酸乙酯提取物溶液。采用平板打孔法，将上述提取物溶液分别吸取0.1ml到培养基的孔中，其中一孔放入0.1ml无菌水做对照，每个浓度做三组重复试验，放入37℃的恒温培养箱中培养24h。结果以培养基孔洞外围刚好没有菌生长的添加物的浓度，就是MIC值；抑菌圈越大，说明抑菌效果越好，MIC值越小。2.2.4数据处理上述实验均经过3次重复实验，将所得的数据进行整理并记录，结果以“均值±标准差”来表示。采用spss17.0对数据进行方差分析和多重比较。3结果与分析3.1长裙竹荪不同部位的抑菌性分析抑菌圈直径是因为在某种抑菌物的周围没有菌的生长,而在远离抑菌物的地方有大量的菌生长。而在不长菌的地方，是一个以孔洞为圆心，形成的一个规则的圆圈。通过十字交叉法测量每个小孔中抑菌物周围不长菌的圆心的直径，即为抑菌圈直径。长裙竹荪不同部位乙酸乙酯提取物的抑菌性结果见表3-1，方差分析结果见表3-4。供试菌株抑菌圈直径（mm）菌柄菌裙菌盖菌托对照大肠杆菌24.33±0.58A20.67±0.58B17.67±0.58C19.00±1.00C——金黄色葡萄球菌25.33±1.15A19.67±1.53C18.33±1.53C22.00±1.73B——沙门氏菌23.33±0.58A19.00±1.73C22.00±1.00AB21.67±0.58B——表3-1长裙竹荪各部位提取物的抑菌结果注：——表示无明显抑菌效果；表中数据肩标字母代表在p<0.01水平上的多重比较结果。表3-2长裙竹荪各部位提取物对大肠杆菌抑菌性的方差分析表平方和df均方F显著性组间74.917324.97249.944.000组内4.0008.500总数78.91711表3-3长裙竹荪各部位提取物对金黄色葡萄球菌抑菌性的方差分析表平方和df均方F显著性组间84.667328.22212.543.002组内18.00082.250总数102.66711表3-4长裙竹荪各部位提取物对沙门氏菌抑菌性的方差分析表平方和df均方F显著性组间29.66739.8898.476.007组内9.33381.167总数39.00011从表3-1和表3-2可知，长裙竹荪不同部位的提取物抑菌性于大肠杆菌的差异是极显著的（p<0.01）。其中菌盖对大肠杆菌的抑菌性最差，抑菌圈直径为17.67mm；其次是菌托，抑菌圈直径为19.00mm；然后是菌裙，抑菌性较好，抑菌圈直径为20.67mm；抑菌性最好的是菌柄，抑菌圈直径为24.33mm。从表3-1和表3-3可知，长裙竹荪不同部位的提取物抑菌性于金黄色葡萄球菌的差异是极显著的（p<0.01），其中抑菌性最差的是菌盖，抑菌圈直径为18.33mm；其次是菌裙，抑菌圈直径为19.67mm；然后是菌托，抑菌圈直径为22.00mm；抑菌性最好的是菌柄，抑菌圈直径为25.33mm。从3-1和表3-4可知，长裙竹荪不同部位的提取物抑菌性于沙门氏菌的差异是极显著的（p<0.01）。其中抑菌性最差的是菌裙，抑菌圈直径19.00mm；其次是菌托，抑菌圈直径为21.67mm；然后是菌盖，抑菌圈直径为22.00mm；抑菌性最好的是菌柄，抑菌圈直径为23.33mm。综上分析可知，长裙竹荪菌柄、菌裙、菌盖、菌托等四个部位均具有明显的抑菌性，且不同部位的抑菌性存在极显著的差异。四个部位中菌柄的抑菌性最强，对三种供试菌的抑制效果都是最好的。而菌裙、菌盖、菌托三个部位的抑菌性时好时坏，如长裙竹荪菌裙对沙门氏菌的抑菌性较差，对大肠杆菌的抑菌性比较好；而竹荪菌盖对大肠杆菌的抑菌性比较差，对沙门氏菌的抑菌性较好；竹荪菌托对大肠杆菌的抑菌性较差，却对金黄色葡萄球菌的抑菌性比较好。3.2长裙竹荪不同部位最低抑菌浓度的确定为进一步确定长裙竹荪不同部位抑菌活性的大小，本研究采用测定最低抑菌浓度（MIC值）来进行判定。最低抑菌浓度是指能够完全抑制培养基内细菌生长的最低药物的浓度，是测量生物抗菌活性大小的一个指标，即培养基孔洞外围刚好没有菌生长时的添加物浓度。长裙竹荪不同部位乙酸乙酯提取物的最低抑菌浓度测定结果见表3-5到表3-8。表3-5长裙竹荪菌柄乙酸乙酯提取物最低抑菌浓度的确定供试菌株菌柄提取物质量浓度（mg/ml）1005025251.5625对照大肠杆菌++++++++++++金黄色葡萄球菌++++++++++++沙门氏菌++++++++++++注：“+++”代表菌落数很多，“++”代表菌落生长较多，“+”代表菌落生长较少，“-”代表无菌生长，下同。表3-6长裙竹荪菌裙乙酸乙酯提取物最低抑菌浓度的确定供试菌株菌裙提取物质量浓度（mg/ml）1005025251.5625对照大肠杆菌--+++++++++++++++金黄色葡萄球菌-++++++++++++++++++沙门氏菌-++++++++++++++++++表3-7长裙竹荪菌盖乙酸乙酯提取物最低抑菌浓度的确定供试菌株菌盖提取物质量浓度（mg/ml）1005025251.5625对照大肠杆菌-++++++++++++++++++金黄色葡萄球菌-++++++++++++++++++沙门氏菌++++++++++++表3-8长裙竹荪菌托乙酸乙酯提取物最低抑菌浓度的确定供试菌株菌托提取物质量浓度（mg/ml）1005025251.5625对照大肠杆菌-++++++++++++++++++金黄色葡萄球菌--+++++++++++++++沙门氏菌--+++++++++++++++由表3-5可知，长裙竹荪菌柄提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的MIC值都是25mg/ml，结合表3-1的实验结果可以看出，长裙竹荪菌柄对金黄色葡萄球菌的抑菌性最好。从表3-6可知，长裙竹荪菌裙提取物对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌性比较差，MIC值都是100mg/ml；而竹荪菌裙提取物对大肠杆菌的抑菌性最好，MIC值为50mg/ml。从表3-7可知，长裙竹荪菌盖提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性较差，MIC值都为100mg/ml；而竹荪菌盖提取物对沙门氏菌的抑菌性最好，MIC值为25mg/ml。从表3-8可知，长裙竹荪菌托提取物对大肠杆菌的抑菌性较差，MIC值为100mg/ml；而对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌性较好，MIC值都是50mg/ml。4结论本实验采用乙酸乙酯对长裙竹荪的菌柄、菌裙、菌托、菌盖四个部位进行提取，分析了长裙竹荪不同部位乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌性，并确定了最低抑菌浓度，结论如下：（1）长裙竹荪菌柄、菌裙、菌盖、菌托等四个部位均具有明显的抑菌性，且不同部位的抑菌性存在极显著的差异。（2）长裙竹荪四个部位中菌柄的抑菌性最好，对三种供试菌的抑制效果都是最好的，且菌柄提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌性最好，MIC值都是25mg/ml。（3）竹荪菌裙提取物对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌性较差，对大肠杆菌的抑菌性较好，MIC值是50mg/ml。（4）竹荪菌盖提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性比较差，对沙门氏菌的抑菌性最好，MIC值是25mg/ml。（5）竹荪菌托提取物对大肠杆菌的抑菌性比较差，而对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性比较好，MIC值都是50mg/ml。参考文献罗信昌,陈士瑜.中国菇业大典[M].北京:清华大学出版社,2016.郑杨,邹青青,张岱,等.竹荪的化学成分及生理活性研究进展[J].食品科学技术学报,2013,31(03):39-45.李文力,黎璐,汤洪敏.竹荪抑菌防腐作用研究进展[J].现代食品,2017(11):3-5.才晓玲,刘洋,何伟,等.竹荪生物活性研究进展[J].食用菌学报,2015,22(04):86-90.才晓玲,刘洋,何伟,等.竹荪营养成分及生物活性研究进展[J].食用菌,2015,37(05):1-3.[6]杨威,吴素蕊,樊建,等.棘托竹荪菌丝体抑菌作用研究[J].中国食用菌,2008(6):34-37.[7]刘文波,赵勇,孙晓红,等.竹荪提取物对食源性细菌的抑菌特性研究[J].微生物学杂志,2013,33(4):50-54.[8]谭敬军.竹荪抑菌特性研究[J].食品科学,2001(09):73-75.[9]宋飞飞,尤洁,王倩雯,等.不同溶剂提取菌草竹荪抑菌活性物质的初步研究[J].中国农学通报,2015,31(04):95-98.[10]陈敬华,胡准,郑化,等.长裙竹荪正己烷提取物化学组成及抑菌活性研究[J].天然产物研究与开发,201,24(07):905-909.[11]檀东飞,苏燕卿,吴若菁,等.棘托竹荪乙酸乙酯提取物的抑菌作用研究[J].海峡药学,2002(05):101-103.[12]罗盛莲,游霞,丁聪聪,等.长裙竹荪和棘托竹荪的抑菌作用及其化学成分研究[J].食品工业科技,2012,33(21):70-73.[13]郝景雯，贾士儒，张刚.长裙竹荪乙醇提取物与水提取物抑菌作用研究[J].食品研究与开发，2010，31(10)：8-10.[14]杨玉,刘晓艳,吴枭.竹荪乙酸乙酯提取工艺研究[J].农产品加工（学刊）,2014（07）:29-31.致谢时光飞逝，四年的大学学习生活即将要结束，慢慢的接近了尾声。回首走过的岁月，虽然辛苦却也收获颇丰。在此谢谢我的导师李丹老师，没有老师的悉心指导与帮助下，我的论文就不能顺利地完成。同时，我还要感谢那些帮助过我的老师、舍友、同学们，谢谢你们在我做试验和论文写作的过程中给予我的所有帮助。在实验过程中，我经历了一次次试验的不断失败和改正的过程，论文的写作是个很艰辛很枯燥的过程，但是在导师的严格要求和精心指导下，我认真且顺利的完成了我的毕业论文。最后要感谢我的家人朋友一直以来给予的鼓励和支持，感谢他们给了我勇气和信心让我积极面对生活和学习中所遇到的困扰和问题，激励我顺利完成学业。所有这些帮助与学习都将成为我今后工作和生活的财富。在这个论文完稿之际，特向导师表示衷心的感谢！

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