血友病的基因诊断

1血友病的基因诊断2背景血友病A10～20/10万，绝对患病数约13～26万（中国）无完整的诊断体系，误诊、漏诊、病死率高替代治疗：传播疾病，经济负担重感染HCV，HBV，HIV，$14万/年/人（美国)致死（残）率极高

遗传后代3FVIII(Xq28)FIX(Xq27)qpX染色体血友病A、B4内含子22倒位5结果（1）

内含子22倒位检测结果6内含子1倒位机制7内含子1倒位检测方法2Kb1.5Kb2Kb1.5Kb8血友病携带者和产前诊断流程PCR扩增外周血DNA抽提（携带者）直接核酸测析间接联锁分析明确诊断长链PCR检测内含子1,22倒位血友病A①、②、③羊水DNA抽提（胎儿）①③②间接基因诊断血友病A10

第一代标志

F8基因内的BclⅠRFLPF8基因内两个STR位点F8基因外的St14VNTR11

家系15BclIRFLP位点多态性连锁分析12家系13st14位点VNTR多态的基因连锁分析13内含子13中STR多态位点用于家系12基因连锁分析146个与F8紧密连锁的STR位点：

DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073和DXS1108距F81.5Mb内1个F8内的STR位点(F8Civs13)性别位点为牙釉蛋白基因（Amelogeningene）终产物X染色体102bp，Y染色体108bp第二代标志15第三代位点的开发对象：69名正常女性、31个血友病A家系（120名相关成员）方法：在人类基因组数据库中选择了位于F8基因两端0.5CM内的三个STR位点（5_226、5_147及3_486），F8基因内的1个STR位点（INTRON25）及距离F8基因2CM内的DXS8069位点，以多重荧光PCR法检测5个微卫星位点的多态性16F8CA22DXS1073G6PDDXS9901DXS15DXS1108ST14F8Civs13F8Intron25DXS10735-226F8Civs133-4865-147DXS806917Marker杂合度多态性单独可诊断率5_22672.46%1280.65%5_14749.27%654.84%DXS806972.46%664.52%3_48649.27%658.06%INTRON2531.88%341.94%联合5个STR位点可对所有要求做携带者及产前诊断的血友病A家系提供遗传连锁分析结果且与F8基因直接检测结果相符结果与讨论187重荧光PCR技术降低重组发生率未见漏诊和误诊诊断率和准确率100％F8Intron25DXS10735-226F8Civs133-4865-147DXS8069结果与讨论特殊血友病A家系的基因诊断

20先证者自幼皮肤、头颅撞伤后及拔牙及手术后有出血难止，曾发生过颅内出血BT、PT正常APTT延长，FVIII:C2%输注全血或抗血友病球蛋白治疗有效先证者已故21FVIII:C

2%22直接基因测序结果：直接测序未检测出突变。原因：据文献报道FVIII直接基因测序有1%-10%的患者查不到基因突变（HumMutat.2002Oct;20(4):267-74）突变可能在内含子中可能存在大的缺失

23携带者诊断结果携带者及待检者F8内含子22倒位均为阴性

24间接诊断结果

BclI酶切图

III-1表姐：

-/-II-2舅妈：-/-II-3母亲：+/-II-4父亲：+/+III-2待检者：+/+M25BclI酶切图测序图BclI酶切识别位点T/GATCA图a待检者测序图，含BclI酶切位点图b表姐测序图，不含BclI酶切位点ab26间接诊断结果

ca13基因扫描III-1表姐：144/144III-2待检者：142/142II-3母亲：142/144II-2舅妈：140/144II-4父亲：142/-27间接诊断结果

ca22基因扫描III-1表姐：79/79III-2待检者：79/83II-3母亲：83/79II-2舅妈：79/79II-4父亲：79/-28血友病A携带者间接诊断结果分析表姐舅妈父亲母亲待检者综合A13、CA22及BclI信息，待检者与其表姐有不同的X染色体。舅舅女性血友病A的基因及产前诊断30标本来源

先证者（II-1），女，21岁，汉族，自幼有踝关节及膝关节有自发出血，临床诊断为血友病A，冷沉淀及浓缩FVIII输注有效，因怀孕要求作基因诊断及产前诊断？？APTTsPTsTTsFgg/LvWF%FVIII：C%I-128.911.317.73.3141121I-227.21018.62.4124118II-175.212.117.72.11212.1II-23911.518.82.8142107II-340.112.520.651.916411931基因检测结果F8内含子22倒位F8内含子1倒位先证者阳性（携带者）阴性胎儿阴性阴性其他人阴性阴性先证者F8基因所有外显子及其侧翼序列扩增测序（-）32遗传连锁分析319218150282340172374323212150282346172365319218150282340172374325220150280340172374325220150280340172374319218150282340172374325220150280340172374323212150282346172365325220150280340172374HA患者正常男性胎儿正常女性先证者图2家系多态性位点遗传连锁分析图IIIIII121234132521213028034017237432521213028034017237433X染色体随机灭活模式检测

先证者来自母系的X染色体大部分被灭活，而来自父系的X染色体保留活性家系其他成员及胎儿为X染色体随机灭活家系成员HpaII酶切前HpaII酶切后SizeHeightSizeHeight父I-131074483104083母I-2298/3041502/1183298/304285/135先证者II-1304/3102543/2424304/3101233/49妹II-2298/3106054/5233298/3103208/2166弟II-33047122304917胎儿III-1307/3106475/6024307/3101337/216334发病机制先证者一条X染色体发生了F8基因内含子22倒位，而未检测到其它F8基因相关突变遗传连锁分析发现该女性患者的两条X染色体分别遗传自其父母，排除其为单亲二倍体先证者的X染色体灭活呈非随机性灭活，其遗传自父亲的X染色体大部分保留了活性35女性血友病A

女性血友病：(FVIII:C3.4%,FVIII:Ag4.2%Leu1975Pro

和3637-3638insA父亲：(FVIII:C6.9%,FVIII:Ag7.4%),Leu1975PromutationJThrombosisandhaemostasis2006363637-3638insA突变是如何产生的?PCR扩增患者的cDNA（2809bp，exon14toexon19），该片段含上述两种突变，产物进行TA克隆测序测序结果显示该突变来自患者的母亲父亲的等位基因母亲的等位基因373637-3638insA突变是如何产生的?母亲外周血DNA的F8基因没有检测到基因突变母亲不同组织的DNAF8基因检测也没有检测到突变，说明母亲不是体细胞的嵌和体表明女性血友病患者3637-3638insA是一种自发突变（denovo）38框移突变(3637-3638insA)定量

RT-PCR显示：患者的FVIIImRNA减少结论：女性血友病A患者是其F8基因中来自父亲的Leu1975Pro突变和自发突变

3637-3638insA，双重杂合突变导致的39一个血友病家系，父亲为血友病A，儿子为血友病B同时存在HA和HB患者家系的基因诊断HAHB40FVIII(Xq28)FIX(Xq27)qp染色体X血友病A、B＋41ResultofphynotypedetectionFamilymember

APTT（s）PT（s）TT（s）Fg（g/L）FⅧ:C（%）FⅨ:C（%）I-337.312.316.82.8149.0104.7I-442.514.017.04.3128.094.4II-139.512.116.42.5154.078.3II-340.612.517.02.5145.068.4II-688.012.215.33.20.398.3II-739.912.519.82.198.082.2II-836.611.616.32.8139.098.1III-790.012.016.22.375.81.9Referencerange

35±1013±317±32.0-4.050-15050-15042基因诊断结果

F8INV22：父亲（＋）其他成员（－）

F8INV1：所有成员（－）F9测序:儿子mutation(32772A→T，Ser365Cys),

母亲同位置杂合子阿姨、外公（－）父亲（－）43

Resultoflinkageanalysis

399340208166313365399340208166313365399340208166313365399340208166313365389336210164313358395350212180313358395350212180313358395350212180313358ⅠⅡⅢ346789107？？＋：FIX基因缺陷＋＋__44外周血细胞、组织细胞外公体细胞、生殖细胞嵌合体外公

阿姨Peripheralbloodbuccalcavitycells

Enqomphesisrate:14.1%嵌合体检测

45凝血因子V和VIII联合缺陷；常染色体隐性遗传性疾病；发病率为1/100万，男女均可发病致病基因并非F5，F8基因，而是与蛋白转运相关受体的编码基因突变导致：LMAN1（70%），MCFD2（30%）分子发病机制研究F5F8D家系基因诊断46F5F8D家系基因诊断先证者1：10岁女孩，口腔粘膜反复出血患者母亲怀孕要求做产前诊断47二、F5F8D家系基因诊断先证者2：50岁女性，贫血，凝血功能不佳，长期痔疮出血先证者3：47岁女性，凝血功能不佳48二、F5F8D家系基因诊断先证者4：50岁男性，平时无明显的凝血功能异常现象，因痔疮出血难止于术前进行凝血功能筛查49先证者APTTsPTsFV:C%FVIII:C%182.219.69.124.2271.622.17.625374.618.314.519.6470.318.29.415.7F5F8D家系实验室检测结果50F5F8D家系基因检测结果先证者1：LMAN1：Exon8nt925-933insA305frameshift编码20个氨基酸后终止LMAN1：Exon11nt1387C>CT(X71661.1)456Arg>Stop母亲父亲产前诊断：胎儿女性，且携带了来自父亲的突变51先证者2、3：MCFD2：Exon4nt501T>C，导致第136位氨基酸错义突变，136Ile>Thr

F5F8D家系基因检测结果52F5F8D家系基因检测结果先证者4：LMAN1：Exon5nt636C>T，导致202R>Stop先证者4之子（杂合子）：LMAN1：Exon5nt636C>CT间接诊断中的基因重组54HA家系情况先证者II-3为重型血友病A患者，F8C<1.0%II-5要求作携带者诊断?55HA家系检测结果22倒位：均为阴性1倒位：先证者（II-3）为阳性，女性（II-5）为携带者。2Kb1.5Kb2Kb1.5Kb56HA家系遗传连锁分析的结果5A1542032031241568086C1542032031241568496B1541951951281568086ⅠⅡ123B1541951951281568086C1542032031281568086A1542032031241568086？F8F8F8F857HA家系诊断结果内含子1倒位是该家系HA发生的致病机制，II-5为内含子1倒位携带者遗传连锁分析发现II-5在ST14，DXS15，DXS9901，G6PD与DXS1073，F8Civs13，CA22，DXS1108间发生染色体的同源重组58结论

在应用间接诊断进行HA家系携带者及产前诊断时，不能仅使用单一的位点进行诊断，必须联合应用多