医学课件体外放射分析

体外放射分析

Invitroradioassay放射免疫分析免疫放射分析放射受体分析受体放射分析竞争性蛋白质结合分析放射性酶学分析等ZhangYongxue体外放射分析定义

是指在体外条件下，以放射性核素标记的配体为示踪剂以结合反应为基础以放射性测量为定量手段对微量物质进行定量分析的一类分析方法的总称。主要方法放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。其中以放射免疫分析和免疫放射分析应用最为普遍。不仅可用于样品中蛋白质、多肽、甾体类激素等物质的测量，而且可用于具有生物活性的小分子物质的检测，如血药浓度测定等。基本原理竞争性结合分析放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一类检测技术。放射免疫分析的基本原理是以抗原及其特异性抗体在适当的反应体系中能够发生免疫反应，形成抗原抗体复合物为基础的。

K1Ag+AbAg.AbK2

K1=Ag、Ab正向结合为Ag.Ab复合物的速率常数；

K2=Ag.Ab复合物离解为Ag和Ab的速率常数；K1在早期明显，K2在后期明显，一定时间后达到平衡状态，两者保持相对恒定，但K1>K2。K1与K2之比为亲和力常数，Ka=K1/K2，K越大越好。K2与K1之比为平衡离解常数，Kd=K2/K1。放射免疫分析为了定量地测定待测样品中抗原的含量，如在这个体系中加入放射性核素标记的同类抗原，体系中同时存在两个平衡。

Ag＋AbAg.Ab＋

Ag*

Ag*.Ab分析原理Ag*与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性与Ab结合，当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag之和大于Ab时，则Ag*.Ab复合物的形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关系，即随着Ag浓度的增加，Ag*.Ab复合物也减少，因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制。竞争性结合分析条件Ag*与Ag的免疫化学性质相同；Ag*与Ag之和大于Ab，Ag*与Ab的量保持恒定。结合率抗体稀释度50%50％的最大结合率为抗体工作浓度标准曲线如果采用系列已知浓度的标准品在相同条件下进行分析，测得各标准点的结合率(B/F)，以结合率对标准品量作图，可以得到一条标准曲线。通过这条标准曲线即可查得未知浓度的待测样品的含量。

B/F已知Ag浓度非竞争性分析免疫放射分析是典型的非竞争性体外放射分析。它应用标记抗体作为示踪剂，在反应系统中加入过量的标记抗体、待测物（或标准品）进行全量反应，未结合的标记抗体通过加入免疫吸附剂而去掉，因此，溶液中放射性与待测物的浓度呈正相关。基本类型以抗原抗体间的免疫反应为基础的分析技术放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是以抗原抗体的免疫反应为基础，利用待测抗原与定量的标记抗原同有限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为微量定量手段，获得待测生物样品中抗原浓度的技术。免疫放射分析

免疫放射分析(Immunoradiometricassay,IRMA)也是以抗原抗体的免疫反应为基础，不同的是放射性核素标记的是抗体，以过量标记抗体直接与待测抗原结合。为非竞争性结合分析。

Ag＋Ab*(过量)===Ag.Ab*＋Ab*(1)单位点法：Ag＋Ab*(过量)Ag.Ab*＋Ab*(加抗原吸附剂去除多余Ab*，上清为结合部分)。

双位点法(Ab2为McAb)具有代表性的固相免疫放射分析法：固相Ab1(试管壁上)+Ag(固相)Ab1.Ag

(过量)+过量Ab*2((McAb)固相Ab1.Ag.Ab*2+剩余Ab*(洗去)

双位点法(Ab1为McAb)固相Ab1-McAb(试管壁上)+Ag(固相)Ab.Ag(过量)+

Ab*2(过量)

固相Ab1.Ag.Ab*2+剩余Ab*(洗去)

最后抗原被夹在两种抗体分子之间，测固相上的放射性(结合部分)。此法过量标记抗体易去除,NSB较低，灵敏度高；抗原结合部分需要有两个特定的抗原决定簇，故特性较高。标记第三抗体法与双位点法相似，只是两种抗体均不标记，而是反应结束后，加入非特异的125I-第三抗体(兔抗鼠IgG)，与抗原－抗体复合物结合，达到测量结合部分的目的。RIA与IRMA的异同均为以抗原抗体的免疫反应为基础，测定对象为物质的抗原；RIA

☆为竞争性，标记物为抗原

☆结合部分放射性与待测抗原浓度呈负相关,在直角坐标系呈曲线

☆为了产生竞争,抗体仅使用结合50%抗原的量,故灵敏度较免放法低IRMA为非竞争性，标记的是抗体，且为过量（高滴度）结合部分放射性与待测抗原浓度呈正相关，因抗体为过量，不存在竞争结合，故结合在固相物上的放射性计数与抗原浓度呈正比，在直角坐标系近似直线；但当待测抗原浓度超过一定范围时，则正比关系消失，出现“平台效应。浓度过高出现的平台效应

被测物质浓度标准曲线的有效范围结合率（%）

因抗体为过量，抗原全量参与反应，反应更为迅速，灵敏度高标准曲线工作范围大由于使用单抗，其特异性好免疫放射分析仅适用于多肽和蛋白质大分子物质的测定，要求抗原不少于两个以上的抗原决定簇（通常一个抗原决定簇至少由5-6个氨基酸组成，故理论上少于10个以下氨基酸的小分子物质无法建立免放分析法）

因使用固相法，操作更简便，易于分离（固相材料有多种）标记抗体比标记抗原容易,可获得高比度的抗体。

以配体与受体间的结合反应为基础的分析技术放射受体分析放射受体分析(Radioreceptorassay,RRA)也是竞争性结合分析法。与放射免疫分析不同的是以特异性受体蛋白质取代抗体。利用待测配体及定量的标记配体与有限量的特异性受体蛋白质竞争性结合，测得样品中配体的浓度。反应原理

Ligand+ReceptorL.R+

L*

L*.R受体放射分析受体放射分析(receptorradioassay)是以分析受体的数量和性质为目的一定量受体只能与一定量的标记配体（受体激动剂和阻断剂）结合，受体具有一定的饱和度根据复合物的最大放射性及所用标记配体的比活度推算出受体的数量，并利用scatchard作图法求出受体的亲和力常数，以反映受体的性质等。

L*+R===L*.R+L*受体容量分析已知量

配体123B%受体受体容量(mol)两者比较相同点都是标记配体，配体与受体的结合反应，反映生物活性。不同点前者测配体含量，后者测受体容量，前者为竞争性，后者为饱和分析。

以酶与底物间的酶促反应为基础的分析方法主要有两类方法放射酶分析法：以酶为结合剂，测量配体的含量；酶的放射化学测定：以放射性标记的底物为配体，测定酶的活性。

竞争性蛋白质结合分析基本技术标准品

质的要求与待测配体属同类物质与待测配体有同等的活性和亲和能力纯度高，不含其它杂质、稳定性好

量的要求

定量精确标记品合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量等）标记物的用量要小，应等于或低于待测物的最小量足够的比活度放化纯度高免疫活性稳定性好，贮存不易脱标特异性结合剂抗体、受体、酶、蛋白质特异性(specificity)：不受交叉反应的程度亲和力(affinity)：配体与结合剂相互结合的程度，是反映结合剂质量的主要指标。可用亲和力常数表示。滴度(titer)：在没有待测物的条件下，结合50%的标记配体时的结合剂稀释度。分离技术免疫分离法：利用抗原抗体结合形成的复合物化学分离法：PEG等物理分离法：电泳、层析、离子交换、活性炭或树脂吸附等生物分离法：葡萄球菌A蛋白（SPA）固相分离法：包被试管、塑料球、磁化分离技术等。标准曲线的拟合方式标准曲线是衡量待测样品中配体浓度的客观尺度，也是反映检测质量的指标。标准曲线要最大限度地反映量、效关系，便于自动化分析，使用灵活。每一批分析必须做一条标准曲线。常用的方法有log-logit坐标系及线性回归法：是目前公认比较好的拟合方法，它是以结合率的logit值为纵坐标，以标准品浓度的对数值为横坐标，制成散点图，然后用最小二乘法对各散点进行直线回归，得出回归方程，获得标准曲线，可用计算机或计算器完成。Log-Logist作图法logitY=a+blogitY=ln(logX/1-B/Bo)

a＝截距b斜率为"-"值