靶向蛋白降解技术的发展 2024

靶向蛋白质降解技术和新一代降解剂处于研发风口。本文汇总溶酶体和蛋白酶体途径的多种创新降解技术。细胞内蛋白质降解长久以来的研究让我们对细胞内蛋白质的合成有了比较全面的了解。关于细胞内蛋白如何降解，以及降解对细胞调节的作用，其研究历史相对较短。目前已知蛋白质在细胞中的半衰期从几分钟到几天不等，蛋白质降解速率的差异对细胞调节有重大影响。转录因子等调节蛋白会降解，而细胞增殖相关的其他蛋白则会因特定信号而分解，错误蛋白会被识别并清除，以避免对细胞造成损害1。真核细胞中的蛋白质降解有两条主要途径：泛素-蛋白酶体途径和溶酶体蛋白水解途径1。对蛋白质泛素标记及其通过蛋白酶体周期性降解的发现，标志着人们认识到蛋白质降解剂对细胞整体平衡的重要性。除蛋白酶体外，溶酶体也是许多蛋白质的“终点”（图1）。这些膜结合细胞器在细胞新陈代谢中发挥作用，其中包括降解通过内吞作用摄取的细胞外蛋白质以及稳定更替细胞质细胞器。通往溶酶体的途径多种多样。自噬是其中一种，在此过程中，自噬体将目标蛋白包裹起来，这些与膜结合的结构最终与溶酶体融合，以确保降解进行。另外还有内吞作用和吞噬作用，这些过程会将较大的颗粒吞入囊泡中，随后囊泡与溶酶体融合，进行降解。对细胞内蛋白质降解途径和能力的研究成果已被用于治疗和药物研发。小分子诱导的靶向蛋白质降解为精确控制异常蛋白水平提供了机会。去除受损细胞器或其他分子的降解技术正在研究中。下文聚焦靶向蛋白降解和新型降解剂的研究进展，简述其在不同疾病领域的应用。人们对细胞运作机制的了解不断加深，推动了药物开发领域的进一步创新。靶向蛋白质降解的几种类型靶向蛋白质降解为称作“降解剂”的小分子物质从细胞中清除疾病相关蛋白提供了多种可能2,3。这种技术可用于消灭细胞中的异常蛋白，包括很多曾经被认为不可成药的蛋白质靶点。此前，对靶向蛋白质降解的研究主要集中于最终在蛋白酶体中被分解的疾病相关蛋白。在创新技术的驱动下，降解其他疾病靶标（包括DNA/RNA分子、蛋白质聚集体、过氧化物酶体、核糖体、受损线粒体，乃至微生物病原体）的新方法正在涌现4。研究转向溶酶体等新的细胞内蛋白“终点站”，为药物发现开辟了更多可能蛋白酶体和溶酶体降解的区别在靶向降解蛋白质领域，PROTACs和分子胶一直是研究的热点2,3,5。这两种降解剂都是利用泛素-蛋白酶体系统实现蛋白质的靶向降解（图2）。在PROTACs和分子胶研究的启发下，不断有新型降解剂进入我们的视线，这些降解剂可利用内吞作用和自噬将更多靶标送入溶酶体，以分解疾病相关蛋白（图3）。以蛋白酶体或溶酶体为终点，小分子靶向降解可通过多种不同途径实现（图4）。随着新技术的发展，降解剂的范围从细胞内可溶性蛋白和膜蛋白扩展到核酸、功能失调的细胞器、传染性有机体、细胞外蛋白、脂滴甚至聚集蛋白等新领域。这些进展有望为包括但不限于癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病在内的多种疾病带来新的治疗机会。1泛素-蛋白酶体系统靶向蛋白降解嵌合体(proteolysistargetingchimeras,PROTACs)是最有名的一类靶向蛋白质降解剂2。PROTACs是一种双功能分子，由两个基本组成部分：一个是负责与目标蛋白结合的配体，另一个是E3泛素连接酶配体，负责募集E3配体酶。被募集的连接酶将目标蛋白质带到泛素-蛋白酶体系统附近，使其在那里被降在药物发现领域，研究人员正在探索多种方法，来推进PROTACs在靶向蛋白质降解方面的应用。目前，多种PROTACs已进入临床试验阶段，这凸显了靶向蛋白质降解为未满足的医疗需求提供新解决方案的潜力。早期候选药物大多针对各种形式的癌症，如今在其他疾病领域的新应用正在稳步增加。分子胶分子胶是一类小分子，也能通过泛素-蛋白酶体系统促进靶向蛋白质降解。分子胶与连接酶（最常见）或相关蛋⽩质结合，没有连接分子，这是与PROTACs的区别。由于没有连接分子，分子胶的分子量更小，其细胞渗透性和生物利用度比PROTACs更高2。与药物发现和开发中使用的传统占位驱动抑制剂相比，分子胶可为靶向蛋白质降解提供更持久的效果、更强的毒性和更高的药效，而且不易引发耐药性2。2溶酶体系统如前所述，新型降解剂可以通过内吞和自噬功能，利用溶酶体来终结更多目标物（图2B，图4）6。溶酶体是真核细胞中的一种膜结合细胞器，是控制细胞内大分子降解的场所。溶酶体含有多种水解酶，能够分解各种大分子，包括蛋白质、脂类、核酸和碳水化合物。因此，新一代降解剂超越泛素-蛋白酶体系统，利用将更多目标物送入溶酶体的细胞途径。溶酶体可以说是细胞的“垃圾处理系统”，与蛋白酶体相比，可以处理更多的大分子。溶酶体中的降解酶在酸性条件下发挥最佳功能，这种环境由溶酶体膜上的质子泵维持。因此，酸性环境对溶酶体水解酶的高效多种溶酶体途径为靶向降解多种异常蛋白提供了创新空间。大多数新一代降解剂都通过核内体-溶酶体途径或自噬-溶酶体途径发挥作用。接下来，我们将介绍这两种途径以及相对应的一些新兴降解剂。核内体-溶酶体途径核内体是真核细胞中的膜结合细胞器，在细胞内分子的分类、处理和输送中发挥着重要作用。核内体是内细胞途径的一部分，通过形成囊泡将细胞外物质内化到细胞内（图2B）。核内体与溶酶体和高尔基体等其他细胞器协调运作。一些新型降解剂可通过内吞作用进入细胞，并通过核内体-溶酶体途径到达溶酶体，在溶酶体中将输送目标蛋白降解。从理论上讲，这为降解大多数细胞外蛋白和膜蛋白提供了途径，这些蛋白质加起来约占蛋白质组的40%6,7。溶酶体靶向嵌合体(lysosome-targetingchimaeras,LYTACs)可能是最有名的核内体-溶酶体降解剂。LYTACs可以结合膜蛋白（或细胞外蛋白）的细胞外结构域和细胞表面的溶酶体靶向受体（也称溶酶体穿梭受体，LTR；见图5）。三元复合物形成后，蛋白质通过凝集素介导的内吞作用内化。GlueTACsGlueTACs（GlueTargetedChimeras）是另一种核内体-溶酶体降解剂，可以靶向细胞表面蛋白。GlueTACs结合纳米抗体、抗原以及细胞穿透肽和溶酶体分选序列（CPP-LSS）的使用，以促进靶标的内化和溶酶体降解。纳米抗体取代了传统抗体，实现细胞穿透。纳米抗体和抗原通过共价相互作用来克服低结合亲和力。GlueTACs还处于早期开发阶段，目前正在进行进一步研究，以全面确定其作用机AbTACs基于抗体的PROTACs（Antibody-basedPROTACs简称AbTACs，是一种新兴的核内体-溶酶体降解剂，可作用于细胞外或膜蛋白。虽然名字中包含“PROTAC”，但AbTACs与LYTACs更为相似。AbTAC利用的是双特异性抗体。其中一个抗体臂靶向细胞表面的目标蛋白；另一个抗体臂靶向跨膜E3连接酶。AbTACs分子诱导“货物”内化，随后在溶酶体中降解目标蛋白质。目前正在进一步研究其确切的作用机制，包括泛素化步骤的细节。自噬-溶酶体途径自噬是涉及细胞成分（包括受损细胞器和蛋白质）降解和再循环的一种细胞过程，是维持细胞稳态或有效运作所必需的。“autophagy”一词源于希腊语，意为“自我吞噬”，反映了细胞吞噬和降解自身成分的方式（图2B）。当吞噬泡包裹住细胞内容物时，自噬过程启动。吞噬泡将“货物”封闭，形成双层膜包裹的自噬体囊泡，囊泡与溶酶体融合，释放内容物进行降解6。AUTACsAUTACs(AUtophagy-TArgetedChimeras)是一种自噬-溶酶体降解剂，由三部分组成：基于cGMP的降解标签、连接分子，以及适合目标蛋白质或细胞器的小分子配体。cGMP降解标签基于核苷酸8-硝基环鸟苷单磷酸，是细胞内的一种信号通路分子，可以募集自噬体（图2A）。自噬体除了能降解细胞蛋白质外，还能降解线粒线粒体功能障碍与多种与年龄相关的疾病和其他疾病有关，清除受损细胞器是满足临床需求的一种有吸引力的策略。AUTACs除了降解目标蛋白本身外，还具有降解蛋白质聚集物的功能，因此具有广泛的应用前景。ATTECs自噬小体绑定化合物(AutophagosomeTetheringCompounds,ATTECs)也是一种自噬-溶酶体降解剂，可将目标蛋白绑住或连接到自噬体（图6）8。ATTEC与LC3结合，LC3是酵母Atg8（自噬相关蛋白8）在哺乳动物中的同源物，也是自噬体特有的关键蛋白。自噬体是双层膜囊泡，包含要被降解的细胞质物质。在自噬过程中，自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体（图6）。融合过程使溶酶体酶降解自噬体的内容物，包括在ATTEC作用下与LC3结合的任何目标蛋白质。也有研究指出ATTEC以脂滴为靶标。一些小分子ATTEC既能结合LC3蛋白，也能结合脂滴。因此，ATTEC也可利用自噬-溶酶体途径降解非蛋白质物质。有研究发现，ATTEC能够识别突变亨廷顿蛋白，特别是导致亨廷顿病的缺陷蛋白的多聚谷氨酰胺区段，有望成为治疗神经退行性疾病的新方法。AUTOTACs(AUTOphagy-TArgetingChimera)也能将特定蛋白质募集到自噬体，最终在溶酶体内降解。AUTOTACs与p62和目标蛋白质结合。p62（又称SQSTM1）是多泛素化“货物”和自噬体之间的桥梁。p62蛋白是一种多功能蛋白，参与包括选择性自噬在内的多种细胞过程。p62包含多个蛋白质-蛋白质相互作⽤域，使其能够与泛素化“货物”和LC3（参与ATTECs机制的相同蛋白）相互作用。因此，添加AUTOTACs可以将目标蛋白与p62连接起来，这种连接方式与目标蛋白质上的泛素无关。ATTEC分子同时结合LC3和目标蛋白，AUTOTACs是结合p62和目标蛋白，但LC3结合是在p63发生构象变化后的下一步。技术发展对PROTAC和分子胶的研究已经积累数十年。靶向蛋白质降解剂的新技术，以及利用不同降解途径的方法，乃至降解细胞中更大成分（包括有缺陷的细胞器）的方法也在不断出现。2004年，AaronCiechanover、AvrimHershko和IrwinRose因发现泛素调控蛋白降解获得诺贝尔化学奖。当时蛋白质如何分解还没有受到太多关注。蛋白质泛素标记及其在蛋白酶体中周期性降解的发现，不仅加深了人们对细胞分裂、DNA修复、蛋白质质量控制和免疫学等过程的理解，还强化了这样一种观点，即通过研究细胞的原生降解系统可以获得有用的药物。目前，临床试验中的大多数靶向蛋白质降解剂都用于治疗癌症。现有方法和新方法的扩展为治疗神经退行性疾病、炎症和自身免疫性疾病、病毒感染等疾病带来了巨几乎每天都有新的靶向降解概念出现6。靶向蛋白质降解和更多创新型靶向降解剂的领域正在迅速扩大，新的名称也在不断涌现。如图3所示，与PROTACs和分子胶提供的靶向蛋白质降解方案相比，ATTECs、AUTACs、LYTACs、AbTACs、GlueTACs和AUTOTACs都是新生力量。这些令人期待的新技术还在起步阶段，有广阔的发展前景。酶标仪在降解剂研究中的作用酶标仪是助力蛋白质降解研究的多功能工具，能够以经济高效的方式监测从靶标结合到降解的整个过程。先进检测技术有助于提高通量，简化手动操作，从而高效筛选降解剂候选物。BMGLABTECH致力于满足这一研究领域的现有和未来需求，为攻克此前不可成药的蛋白质靶点扩展机会。BMGLABTECH提供一系列涵盖吸收光、荧光和化学发光测量的灵敏检测设备。那么对于与降解剂研究相关的特定需求和应用，哪种酶标仪更适合？其中PHERAstarFSX专为筛选而设计，在降解剂研究中，是高性能高通量检测的首VANTAstar®和CLARIOstarPlus均支持波长扫描，并采用动态范围扩展技术，单次运行即可提供高质量数据。配备线性可变滤光片光栅TM和多种滤光片选择，可提高透光率和灵敏度。对于活细胞检测，还可配备大气控制单元。BMGLABTECH的酶标仪都具有超快的读取能力。Omega系列、CLARIOstar