生物技术制药全册配套完整课件3

生物技术制药全册配套完整课件3生物技术制药科技創造經濟農業時代生技時代資訊時代全球化與經濟附加價值時間與主要技術年代176919472000工業時代BC6000資料來源：TheComingBiotechAge,RichardW.Oliver

生物制药已经成为朝阳产业中的“朝阳”，突出表现在：1.国际上生物技术领域已取得的研究成果中60%以上是医药领域的；2.各国对生物技术的投资80%以上集中在医学生物技术领域；3.生物技术研究开发的60-80%的力量主要集中在医学领域；4.总销售额超过10亿美元的生物技术产品主要为医药生物制品；5.美国1300多家生物技术公司的60%以上，欧洲800多家生物技术公司中近80%集中在医药领域；6.生物制药市场资本总额达3500亿美元，主要生物技术药品有红细胞生成素、胰岛素、干扰素等，年销售额均在10亿美元左右。7.美国FDA正式批准上市的已有117种生物技术药物用于治疗各种疑难病和常见病，仅2001年上半年就批准了27种；8.处于临床研究阶段的有1000多种；9.近20年来，生物技术制药占国际药物和生物制品的份额逐年递增，到2002年已达到13%。463424131165通訊職場生活旅遊2001-2010各大產業之預估成長率Source:WallStreetJournal,May2002Source:,Investorsfuelbiotech’sfuture,01-18-2005全球資金持續投入生技醫藥產業2005年美國股票首次公開發行上市公司(IPO)募款金額與家數比較ToFeb16,2005Nasdaq生技股指數起起伏伏2000年後整體表現優於Nasdaq&Dow平均指數13全球生技藥品市場及成長率14生技藥品市場分配份額15不同研發階段之生技藥品第一节生物制药的概念和内容

生物制药是指利用生物体或生物过程生产药物的技术。生物制药技术是一门讲述生物药物，尤其是生物工程相关药物的研制原理、生产工艺及分离纯化技术的应用学科。应用：治疗和预防疾病；作为研究工具

LouisPasteur

法国人，开创了药物微生物技术的新时代

AlexanderFleming苏格兰人，发现青霉素及其治疗传染性疾病的功效，1945年获得诺贝尔生理医学奖SelmanAbrahamwaksman美国人，对土壤微生物产生抗生素物质进行了系统和开创性工作，发现了抑制肺结核的链霉菌素，1952年获得诺贝尔生理医学奖基因工程技术、原生质体融合技术、突变生物合成技术、微生物转化一生物技术药物的分类一应用重组DNA技术制造的基因重组制剂二基因核酸药物三天然生物药物四合成与部分合成的生物药物（具体例子后面会讲到）（1）天然药物：未经加工或仅简单加工的药物：植物药、动物药、矿物药（2）合成药物：以化学合成方法制得的药物（3）生物技术药物：通过细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等新技术生产的药物：酶制剂、生长激素、疫苗等。二生物技术药物的特性1分子结构复杂2具有种属特异性3针对性强，疗效高4稳定性差5基因稳定性6免疫原性7体内的半衰期短8受体效应9多效性和网络性效应10检验的特异性一生物技术制药的特征生物技术医药产业是产业化、商品化的高新技术产业之一。高技术，高投入，高风险，高收益，长周期‘四高一长’的特点基因工程药物的高回报碱性成纤维细胞生长因子231元/ug红细胞生1072元/ug白细胞介素-2410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug胰岛素10.2元/mgRockfeller大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月）Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年）Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）二生物技术在制药中的应用基因工程技术，转基因技术细胞工程技术，干细胞培养及定向分化酶工程技术，细胞及酶的固定化技术发酵工程技术，生物反应器,胚胎克隆技术生物大分子修饰,生物物理、生物信息及其他相关领域技术

三生物技术制药现状和前景20世纪80年代以来仅美、日开发的生物新药200多种。如：干扰素、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、纤溶酶原激活剂、胰岛素、生长激素、乙肝疫苗等。新试剂新技术不断出现细胞移植用于:骨髓移植治疗白血病、免疫缺陷、再障性贫血等。基因治疗有:致死性遗传疾病、癌症、爱滋病、心脏病等。生物试剂开发单克隆抗体用于诊断和治疗，荧光抗体法、DNA探针、PCR等检测技术的建立。2000年是基因组之年，美国就近100家生物科技公司上市上市生物科技公司的总收入比1999年增加了19%，达249亿美元，同时研发经费也增至95亿美元生物科技公司的市值增加38%，即从99年的3110亿增至2000年的4290亿美元传统医药公司都投入巨资以多种不同形式（内部研发、投资、收购、转让技术或合同研究等）进入生物医药产业表1世界生物技术专利分布

（1996年）地区或国家生物技术专利

/%药物专利

/%人DNA序列专利

/%美国(USA)595140欧洲(Europe)193324日本(Japan)171233其它(Other)543总计(Total)100100100

目前FDA已经批准了117个生物技术药物和疫苗，其中

75%为最近6年批准有350生物技术药物和疫苗针对超过200种疾病正在进行临床试验有几百种诊断试剂应用于疾病诊断、血液检定等美国目前有1273家生物技术公司，其中300家是上市公司

1999年至2000年生物技术市场资产总值增长156%，从1379亿美元增加至3535亿美元

1993年至2000年生物技术工业收入成倍增长，从80亿美元增加至223亿美元美国生物制药现状

美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾病种类产品数量疾病种类产品数量感染性疾病39心脏病26神经系统疾病28呼吸系统疾病22艾滋病及相关疾病19自主免疫系统疾病19皮肤病19移植13消化系统疾病11遗传疾病11血液疾病9糖尿病及并发症7不育症5眼病3生长发育不良症3骨质疏松2妊娠预防2肿瘤疾病175

主治病症生物新药数量癌症400来种阿尔茨海默症26种心脏病、心肌梗塞、AIDS和精神病100多种糖尿病25种关节炎19种帕金毒氏病16种骨质疏松症14种儿童治疗使用200多种当前正在研制的1000多种新药分布美国已进入临床研究阶段的革新性生物技术药物

种类作用AntiVEGF(抗内皮细胞生长因子)

治疗结肠直肠癌和非小细胞肺癌(Ⅲ期临床)Dendriticcellvaccine(树突细胞疫苗)

治疗前列腺癌(Ⅲ期临床)Dendriticcellvaccine(树突细胞疫苗)

治疗乳腺癌(Ｉ期临床)ONYX015(肿瘤抑制治疗基因)

治疗头颈癌(II期临床)AntiIgEhumanizedmonoclonalantibody治疗哮喘(Ⅲ期临床结束)(人源化抗IgE单克隆抗体)PRO542(PRO542抗体)

预防HIVPegasya(PEG修饰IFN)

治疗丙型肝炎(Ⅲ期临床)Recombinathumanparathyroidhormone治疗骨质疏松症(Ⅲ期临床)(重组人甲状旁腺激素)Somatokine(免疫系统激发剂)

治疗严重烧伤(Ⅲ期临床结束)ConXn(松弛素蛋白)

治疗硬皮病(ＩＩ/Ⅲ期临床)ABX-ILB(ABX-ILB抗体)

治疗牛皮癣(ＩＩ期临床)生物药品名称适应性年销售额(亿美元)抗CD3MAb移植排斥0.80DNase囊性纤维变性1.11EPO贫血16.50因子Ⅷ血友病2.50G-CSF嗜中性白细胞减少症9.36葡萄糖脑苷酯酶Gaucher氏病2.15GM-CSF骨髓移植0.41GPⅡb/ⅢaMAb血管造形术中血凝块1.30B型肝炎疫苗B型肝炎10.00人生长激素生长不良，肾功能不全4.50人胰岛素糖尿糖7.00人白细胞介素-2肾癌0.40α-干扰素癌症，肝炎7.00β-干扰素多发性硬化2.55γ-干扰素肉芽肿病0.04tPA心力衰竭/栓塞/中风3.00总计

68.6216种生物技术药物销售情况

FDA批准的生物制品时期批准的数目临床试验期审评期总时间1982-19891432.724.053.21990-19941546.521.367.81995-19992658.614.773.3*时间单位为月3、我国的医药生物技术

已上市的基因工程药物和疫苗

1992年乙型肝炎疫苗

1995年白细胞介素-21996年α1b-干扰素α2a-干扰素

α2b-干扰素

1997年粒细胞集落因子红细胞生成素

我国已批准生产的生物技术药物和疫苗名称作用rhuIFNα1b(外用)病毒性角膜炎rhuIFNα1b乙肝、丙肝rhuIFNα2a乙肝、丙肝、疱疹等rhuIFNα2a(酵母)乙肝、丙肝rhuIFNα2b乙肝、丙肝白血病等rhuIFNα2a(栓剂)妇科病rhuIFNα2b(凝胶剂)疱疹等rhuIFNγ类风湿rhuEGF(外用)烧伤、创伤EGF衍生物烧伤、创伤rhuIL2癌症辅助治疗rhuIL2125Ser癌症辅助治疗上海华晨rhuG－CSF刺激产生白细胞rhuGM－CSF刺激产生白细胞、骨髓移植rhuEPO产生红细胞rhuGH矮小病bFGF(外用)创伤、烧伤RSK溶血栓(心梗)抗IL28单抗乳膏剂银屑病人胰岛素糖尿病乙肝疫苗预防乙肝痢疾疫苗预防痢疾5、医药生物技术发展展望21世纪是医药生物技术快速发展的时期,生物制药、化学药物、中药形成三足鼎立,有效的为人类健康服务。1.利用新发现的人类基因开发新型药物2.新型疫苗的研制：滋病疫苗和基因型癌疫苗等。3.基因工程活性肽的生产及基因药物:淋巴因子、生长因子、激素和酶4.其它医药业将得到不断改造和发展,早期诊断技术，转基因药材重组蛋白质药物的鉴定方法电泳方法：SDS－PAGE、等电聚焦、免疫电泳免疫学分析方法：放射性免疫方法、放射性免疫扩散法、酶联免疫吸附法、免疫印迹受体结合方法HPLC肽图分析EdmanN-末端序列分析法圆二色谱法核磁共振法医药业的现实问题和研究进展挑战与应对20强的股东回报(98年前5年）0102030405060辉瑞Pfizer利来EliLilly先灵宝雅Schering-Plough墨克Merck&Co.施贵宝BMS强生J&JAHP史克SB诺华NovartisAbbottZenecaGWHMRTakeda罗氏Roche拜尔BayerRhonePoulencAstraPharmaciaUpjohn*行业平均22%20强平均29%股东回报率%TSR医药行业曾经是一个很舒适的地方至今为止医药行业的新药研发模式还算成功研发500个验证的目标一个待筛选库有1-2百万个化合物专利对研发的鼓励作用主要病症的治疗覆盖分阶段新药发展，财务与人力风险控制大量临床试验营销创新药价格高多国家或全球推出大量推销与对病人的直接宣传(DTC)周期管理以取得最大回报购买专利来保证治疗药经营特权的延续这一成功服务医药业务人员50年的运作模式正在失去效益。医药行业的发展回顾90年代是医药行业的黄金年代，1993年到2000年中期:FT医药指数: +350%2001-2002年FT指数跌 -50%投资团体对医药行业产生怀疑能量失衡研发生产力的降低专利到期治疗药竞争加剧30354045505560658586878889909192939495969798990510152025303540每年的研发（

R&D）费用($billion)每年开发的新化合物实体（NCE）

4570研发效率在下降

在过去10年，研发成本飙升，但每年上市新药数目下降在今后几年只有14种潜在重磅炸弹药CrestorExantasubstanceppitavastatin(US,EU)pregabalincethromycin预期每年销售达$10亿美元的畅销药 2003 2004 2005 2006Adalimubab(D2E7)Source:Datamonitor,TheNextGenerationofBlockbusters,2002oralinsulinIressaPKC-betainhibitorZetiaArcoxiaCOX-198avasimibe跨国药企对重磅炸弹药品种更为依重少数药品的价值贡献越来越举足轻重，几乎超过了80%。市场上只有不到4%的药品的年均销售额在5亿美元以上。可以说，一个畅销新药的成功几乎能完全提升一个企业。治疗药竞争加剧Source:ScripMagazine(Sept97),PwCCelebrex/Vioxx1998012345678910Invirase1995Recombinate1992Diflucan1990Prozac1988Mevacor1987AZT1987Seldane1985Capoten1980Tagamet1977Inderal1968YearsofexclusivityRelenza/Tamiflu.199910years2months!6years到2005年，前一百位的处方药中有53%将专利到期，它们在1998年的销售收入达到530亿美元——几乎都是畅销药。专利到期对公司价值的影响是巨大的，曾有药企的某专利到期药品在两个月内失去了80%的市场份额。无专利专利保护2000年2005年PercentageofU.S.RxMarketFacingNewGenericCompetition2000年以来，将有大量专利药品面临到期……重磅炸弹药缓慢推出与专利到期对研发的巨大压力……两者都将焦点对准了研发，但研发产出效益始终低迷，无法弥补专利到期的损失。30354045505560658586878889909192939495969798990510152025303540年度研发支出新药上市NCEs$Billion2550450070研发支出销售收入20强的年均研发新药不到一个，却要为一个新药的研发花费7亿美元，而单品销售收入为近2亿美元——如果持续这一水平，意味着投资回报很快会降到零点。跨国药企股东回报滑波……尤其是2000年之后，剧烈下滑几乎波及所有跨国药企，特别是制药巨头们-20-100102030405060PharmaciaPfizerLillySchering-PNovartisRocheBMSJ&JMerckWyethSan-SynAbbottBayerGSKScheringAGTakedaAmgenAventisAZSankyo截止到2002年6月的TSR截止到98年3月的TSR全球医药企业20强98年和02年投资回报比较

新产品上市

缩短时间

购买专利药品协同开发/联盟

全球同时推出提高收入–现有产品市场更深的渗透/DTC

产品周期管理/OTC

产品线延伸协同推销加价

降低成本

提高运营有效性

资产使用许多医药公司使出浑身解数来化解危机合并也不是长久之计-通过对行业的193个合并了解到，89%公司在第三季度面临销售滑坡Source:*MatthiasM.Bekier,AnnaJ.Bogardus,andTimOldham,"WhyMergersFail,ConductedSouthernMethodistUniversity传统药物发现模式受到威胁差异传统的化合物库的限制(1-2百万)规模即使是产业化的筛选流程也是耗费时间的

用现在的筛选系统（uHTS）对500,000靶点进行筛选需要10,000

年。

质量“不能成为药物”的靶点长时间的优化周期

有些化合物有副作用有些化合物进入I期临床试验没有再进行下去

效率低下传统挑战基于文献的靶点确认

基于文献的靶点识别

<1000

基于化学物的筛选

<2百万化合物花费时间确认和获得先导化合物

选择确定作为开发对象的目标化合物工业化探讨（大量制备）临床试验用样品上市销售（GSP)现代创新药物研究开发的大致过程合成情报

提取、结构测定

活性筛选药理生化特殊毒性毒性药效药理一般药理药物动态吸收排泄代谢作用机理急性毒性亚急性毒性慢性毒性致畸致癌

致瘾生殖毒性

理化学性质、制定质量标准稳定性配伍变化试验方法试验规格工业制备方法探讨合成提取精制发酵制剂化探讨III期：毒性、药效（多数病人，多点观察）

II期：毒性、药效（少数病人）

I期：毒性（健康人群）申请临床试验(GCP）申请生产许可(GMP)创新药物源头研究阶段(GLP)

杂志公开发表接受公众检验申请专利在众多生物活性中力求找出最本质的作用

天然药物或中药在临床治疗上可能作用于多个靶点，因而具有多种疗效，即表现出多方面的活性。研究者应当力求找出其中最本质的作用，选择建立反映临床治疗作用特点、且效果与之平行的活性测试体系，才有可能追踪分离出目的活性成分或甚至有效成分。

中药或天然药物名称

生理活性活性筛选体系

目标活性物质

乌头

(Aconitumspp.)强心、利尿兴奋、镇痛Yagi-Hartung法（离体蛙心）

去甲基乌药碱（Higenamine)

乌头碱类大黄（Rheumcoreanum及R.palmatum的杂交种）健胃、缓泻

致泻活性(小鼠)番泻苷(sennoside)

茵陈蒿

(Artemisiacapillaris)利胆、抗炎胆汁分泌促进作用茵陈色原酮

(capillarisin)等

贝(日本产)(Babyloniajaponica)口渴、视力减退、瞳孔散大、言语障碍、便秘atropine定量法（小鼠散瞳率试验)

surugatoxin软紫草

(Arnebiaeuchroma)止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌前列腺素PGE2生合成抑制活性arteriolearnibinone

arnebifuranone

shikonins类

以疾病为导向的发现药物方法将加快发现靶点的速度差异

生物分子库是巨大的

潜在的靶点超过100亿不同的分子*规模针对靶点识别（ID）疾病导向的方法

生物学筛选是动态的

通过分子活性寻找靶点

质量设计相应的分子识别正确的靶点

生物制剂一般有较少的毒性

临床为导向识别靶点有可能加快发现新药因此，临床治疗失败将会大大减少

500,000潜在靶点疾病模型筛选靶点

未来基于生物学的筛选快速的临床前检测

100亿分子

在临床上可以快速识别靶点和治疗效果

优势以疾病为导向的生物学方法使靶点识别更加快速

–针对未来的方法

严密地以确认的疾病模型和基因组为导向的方法是发现新的和疾病相关靶点

使用生物分子来确认可以戏剧性地减少发现靶点的周期

生物学分子被日益用来在临床PoC上使用。生物学分子用于靶点识别的临床周期–PoC<2年*Source:*HGSandCAT,CelltechandAbbottSource:HumanGenomeSciences,PressRelease,May2002TRAIL-R2mAbCancerTherapy

未来的发展过程

不断重复的过程–以及较高的再利用在分子水平对疾病的理解这一点几乎没有争论。

在小型的剂量调整性试验中,安慰剂要最小

–随后上市前的短期试验里要有关于病人的确切的效果真正的的结果是要靠要收集终生试验的资料、价格和风险动态的产品资料要包含新资料终生试验&市场调研

上市6-24月产品生命剂量调整性试验建立临床模型持续不断的市场应用

在药厂、规则制定者和付费者之间需要巨大的整合

高预测性

–模拟是核心。

–要科学性和商业化发展一个完整的系统包括：诊断、服务和设备等

在产品的生命周期里继续向规则制定者进行咨询

以疾病为导向的方法提供快速的药物发展模式和代价现在的模式未来的模式靶点从靶点的识别到上市的时间

12-14年~3-5年上市前的费用

~$800百万<$200百万进入人体使用的成功率

5-10%50%or更多对疾病的重新定义…过去肺病COPD慢性阻塞性肺疾病哮喘器官现在COPD慢性阻塞性肺疾病哮喘

支气管炎症状加重吸烟损害

气管炎症ARDS遗传过敏阻塞症状疾病变化免疫调节肺气肿病理BHRLungDisease未来IgE路径转录激活因子IL5路径嗜酸性粒细胞趋化因子嗜中性粒细胞激活

-1-抗胰蛋白酶蛋白酶等等

生物分子遗传易感性/环境神经肽上皮调节上皮分化将引导未来的治疗方法现在LungDiseaseCOPD慢性阻塞性肺疾病

哮喘

器官目前COPD慢性阻塞性肺疾病

哮喘

支气管炎症状加重吸烟损害

气管炎症ARDS遗传性过敏阻塞症状疾病变化免疫调节肺气肿病理学BHRLungDisease未来IgE路径转录激活因子IL5路径嗜酸性粒细胞趋化因子嗜中性利细胞激活

-1-抗胰蛋白酶蛋白酶等等生物分子遗传易感性/环境神经肽上皮调节上皮分化类固醇b阻断剂吸入性内皮质激素吸入性内皮质激素b阻断剂表面活性剂蛋白酶抑止剂嗜中性粒细胞胰肽酶抑止剂抗IgE抗体CCR5抑制剂IL5抗体Stat-6反义活力半衰期延长了12倍重组人干扰素α2b、重组人β干扰素和人白蛋白融合共表达达到国际水平2003年抗非典期间，江南大学与丽珠集团苏州新宝制药厂合作攻关，通过发酵工程和生物制药工程研制成功了重组人α-2b干扰素口鼻腔喷雾剂，解决了干扰素常温保存稳定性问题。在疫区特殊人群捐赠使用，效果显著。现已被国家SDA作为新药受理（省内唯一被受理的干扰素剂型），并选派参加在巴黎举办的科技成果展。重组人α-2b干扰素口鼻腔喷雾剂发展趋势（1）利用蛋白质工程技术开发新产品（2）采用新的高效表达系统，利用动物细胞，特别是整体动物大量表达基因工程医药产品

（3）将基因组研究成果转化为生物技术新药（4）开发新剂型的生物技术药物传统医药的现代认识TsinghuaUniversityXiangXuePharmaceuticalsInstituteofPharmaceuticalInnovationBradfordRoyalBotanicGardens,KewBrunelInstituteForBioengineeringCambridgeUniversitydeptsandinstitutesImperialCollegeLondonMedicalToxicologyUnit(NHS)LondonSchoolofPharmacyCCCMR展望

人类基因组测序工作的完成，会使我们对人的健康与疾病起因有更深入的认识。尽管第一张人类基因组测序工作草图尚未弄清所有人类基因的功能，但是，一旦这些基因产物（即活性蛋白质）被表达出来，将会有几千种甚至更多具有特殊疗效的蛋白药物的诞生。因此，基因工程药物具有很大的增长空间和发展前景。第三节新型生物药物研制的方法新型生物药物是指利用生物体或生物过程产生的结构新颖的药物。结构新颖是指与以前药物有着不同的化学结构，是—种新的化学实体(Newchemicalentity，简称NCE)。这类新型生物药物国家认定为一类新药。国际上所说的新药开发就是指开发NCE药物。新药评价程序生物技术来源药物的新药评价，原则是相同于一般药物的新药评价，可分为临床前评价和临床评价及生产两方面的工作。但由于生物技术药物的特点，又不完全相同于一般新药的评价和审批。新药研发过程1、制定研究计划，设计实验方案并实施之，获得NCE2、临床前研究，获得IND（investigationalnewdrug）西药临床前22项（新药证书，25项）中药临床前19项（新药证书，22项）新药研发过程3、临床试验（或临床验证），获得NDA（newdrugapproval）

PhaseI:20－30例健康受试者

PhaseII:不少于100例典型患者

PhaseIII:不少于300例患者4、上市后研究，临床药理一类试生产期，PhaseIV:>2000例

新药研发是一项系统工程，涉及多个学科

分子生物学分子药理学生物信息学药物化学计算机科学

药物分析化学药理学毒理学药剂学制药工艺学新药研发特点

投资高周期长风险高利润高竞争激烈Moleculardrugdesign药物分子设计由多学科相互穿插，交替进行药物设计学分子生物学结构生物学基因组生物信息学数学统计学药物化学有机药物化学计算机科学计算化学分子药理学一般药理学先导化合物

Leadcompound

又称原型物（Prototype），简称先导物（Lead），是通过各种途径或方法得到的具有某种生物活性的化学结构。天然生物活性物质作为先导物

天然生物活性物质来源广泛植物动物微生物海洋生物矿物天然生物活性物质作为先导物青蒿素青蒿素Artemisinin黄花蒿Artemisiaannula蒿甲醚Artemether生物利用度较低复发率高天然生物活性物质作为先导物喜树碱羟基喜树碱Hydroxycamptothecin喜树Camptothecaacuminata拓扑替康Topotecan水溶性较差，毒性大天然生物活性物质作为先导物紫杉醇紫杉醇Taxol红豆杉Taxus紫杉特尔Taxotere天然生物活性物质作为先导物局麻药可卡因Cocaine南美洲古柯ErythroxylumcocaLam普鲁卡因Procaine天然生物活性物质作为先导物抗生素类天然抗生素微生物培养液半合成抗生素天然生物活性物质作为先导物他汀类降脂药美伐他汀Mevastatin洛伐他汀Lovastatin辛伐他汀Simvastatin普伐他汀Pravastatin桔青霉菌等Penicilliumcitrinum氟伐他汀Fluvastatin天然生物活性物质作为先导物动物毒素蛇毒Bungarotoxin，N2受体拮抗剂肌松药蛇毒Batroxobin，溶血栓酶抗栓药鱼毒Tetrodotoxin，钠通道阻断剂心血管药物蜂毒Apamin，钙通道阻断剂和钾通道开放剂心血管药物以生物化学为基础发现先导物-1

以生物大分子或复合物为靶点酶：酶抑制剂受体：激动剂、拮抗剂离子通道：阻断剂、开放剂核酸：反义药物从内源性活性物质；酶反应过程（底物、过渡态、产物）；与受体作用过程（配体、激动剂、拮抗剂）；生化级联反应过程等出发基于生物大分子结构或作用机理

Structure-basedormechanism-baseddrugdesign从内源性活性物质发现先导物

5－羟色胺受体激动剂脑内5-HT水平降低会引起偏头痛变换结构以提高对5-HT1受体选择性激动活性5-HT1激动剂舒马普坦（Sumatriptan）用于治疗偏头痛COX抑制剂吲哚美辛类非甾体抗炎药

COX抑制剂吲哚美辛类非甾体抗炎药从酶作用发现先导物

ACE抑制剂ACE的功能将AngiotensinI从羧基端水解掉二肽，活化成AngiotensinII将Bradykinin从羧基端水解掉二肽失活天然ACE底物及一些肽类天然ACE抑制剂每克分子ACE含有一克原子Zn++HypotheticalactivesiteofcarboxypeptidaseAHypotheticalbindingofinhibitorstoACEACE抑制剂ACE的功能羧肽酶A的作用模式肽类抑制剂的结合模式羧烷基脯氨酸卡托普利依那普利等由受体结构特点设计活性化合物作用于同一受体的药物活性构象分析

伸展型构象平面伸展型构象以受体的天然配体为起点

IIb/IIIa糖蛋白受体拮抗剂血栓形成的关键步骤是纤维蛋白原与血小板IIb/IIIa受体结合。被IIb/IIIa受体识别和相互作用的主要区段是纤维蛋白原的三肽片断Arg-Gly-Asp（RGD）。蛇毒或水蛭素中含有RGD的线形或环状肽，是阻断IIb/IIIa受体活化从而抑制血小板聚集的药效团。含有或模拟RGD结构的肽或拟肽可作为纤维蛋白原的拮抗剂，是创制抗血栓药物的一个新途径。IIb/IIIa糖蛋白受体拮抗剂RGDSibrofibanLamifibanH2受体拮抗剂类抗溃疡药

选定靶点－组胺H2受体确立研发目标－抑制胃酸分泌药物建立动物筛选模型－麻醉兔灌胃从H2受体天然激动剂－组胺入手，以其为先导结构，保留咪唑环，改变侧链，开始优化H2受体拮抗剂类抗溃疡药H2受体拮抗剂类抗溃疡药H2受体拮抗剂类抗溃疡药基于生物大分子结构

和作用机理设计先导物合理药物设计

Rationaldrugdesign合理药物设计即以药物作用靶点的三维结构和生物化学功能为基础进行药物设计的方法Structure-baseddrugdesignMechanism-baseddrugdesignStructure-baseddrugdesign了解生物大分子（受体）的三维结构，特别是与配体分子形成的复合物的三维结构，是前提大分子与小分子的结合模式是基础多种方法并用数据库搜寻分子碎片连接从头构建InteractionsbetweenenzymeandsubstratepeptideComplexofHIVproteaseanditsinhibitorPeptidomimeticHIVproteaseinhibitorsP1P1’H-bonddonor/acceptor8.5-12.0Å3.5-6.5Å3.5-6.5ÅHIVproteaseinhibitorsHIVproteaseinhibitors

InteractionsbetweenenzymeandinhibitorsHIVproteaseinhibitorsCHH4.1-6.1Å4.4-6.4Å1.8-3.8ÅHIVproteaseinhibitorsIC50=0.32mol/LMechanism-baseddrugdesignGABA转氨酶抑制剂－氨己烯酸蛋白酶的过渡态类似物抑制剂GABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-Vigabatrin肾素的过渡态类似物抑制剂基于临床副作用观察产生的先导物

作用与作用的分离异丙嗪的镇静作用Promethazine异丙嗪（抗过敏药）Chlorpromazine氯丙嗪（安定）Thiazinamium噻丙胺（支气管扩张）磺胺家族的发展单氨氧化酶抑制剂的发现格鲁米特的芳构酶抑制作用基于生物转化发现先导物磺胺的发现基于生物转化发现先导物抗疟药环氯胍保泰松的代谢活化药物合成的中间体作为先导物药物合成的中间体作为先导物组合化学

Combinatorialchemistry同时制备含众多分子的化合物库以代数级数增加构建块的数目，库容量则以几何级数增加与高通量筛选（high-throughputscreening,HTS）技术结合，可极大地加快先导物发现和优化的速度反义核苷酸

Antisenseoligonucleotides能够与DNA或信使RNA发生特异性结合，分别阻断核酸的转录或翻译功能，阻止与病理过程相关的核酸或蛋白质的生物合成。这种可与DNA或信使RNA结合的互补链称作反义寡核苷酸。PeptideNucleicAcids(PNA)筛选发现先导物随机与非随机筛选Random/nonrandomscreening高通量筛选

High-throughputscreening(HTS)虚拟筛选

VirtualscreeningVirtualscreening用计算机筛选的方法称为虚拟筛选，或称insilico筛选，成为insilico-invitro-invivo模式。用一系列“基于知识的滤片”对虚拟库“筛选”，以“浓缩”出能够满足预定标准的化合物。这些滤片包括类药性(druglike)，药代动力学性质，毒性，知识产权问题以及与受体的互补性或与配体的相似性等，是通过数据库搜寻和计算化学实现的。Virtualscreening抗体导向酶催化前药

Antibody-DirectedEnzymeProdrugTherapy,ADEPTTarget表面抗原单克隆抗体＋酶前药原药ADEPT的酶系羧肽酶G2（CPG2）羧肽酶A碱性磷酸酶糖苷酶青霉素酰胺酶

-内酰胺酶MMCI前药＋W14F(ab)2-CPG2MMCI作为CPG2的底物优于氮芥；原药的细胞毒作用也更强。体外绒毛膜癌细胞系试验，前药加酶活性强于前药活性100倍。体内试验可完全或明显抑制肿瘤生长。ADEPT－

-Lactamase癌细胞单抗-内酰胺酶第二章基因工程与药物蛋白生产

GeneticEngineeringinMedicineandIndustrySometherapeuticproductsforusedinhumansGenentech公司1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！Genentech的骄人业绩1976Genentech创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）1984第一个VIII因子，转让给CutterBiological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（tPA）1990生产interferon

1

1990与瑞士Roche医药公司合并（$2.1billion）美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称商品名称英文名缩写开发公司胰岛素Humulin

Novolin

HumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生长激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干扰素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN

1brhuIFN

1brhuIFNa3ScheringRocheBiogen

ChironGenentechInterferonScience白细胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒细胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒细胞巨噬细胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex红细胞生成素EpogenProcritrhuEPO

AmgenOrtho组织溶纤原激活剂ActivaserhuTPAGenentech生长激素SerostinsomatotropinSerono促生长素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSerono

Pharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral抗血友病因子VIIIKogenate

RecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄脑苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脱氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline体内用单克隆抗体Reopro

OrthoOKT-3Onco

ScintCR/OVOnco

ScintOC103Onco

ScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocor

OrthoBiotechCytogen

Cytogen

Cytogen

Cytogen鼠单克隆抗体PanorexMurineMABGlaxoWelcome1中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）药品名缩写开发生产公司批准时间适应症rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a长春生研所上海生研所深圳兴科长春生研所长生药业三生药业1989试1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖锐湿疣，疱疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲药业里亚哈尔华立达安科华新1997正1996正1997正1997试1997试HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVrhuINF

上海生研所克隆丽珠生物工程1994试1995试1995试类风湿类风湿类风湿rhuIL2长春生研所长春药业四环制药华新三生药业深圳兴科中华合通金丝利康利制药1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995试1995试1995试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗rhuG-CSF九源1997试化疗生白血病rhuGM-CSF特宝1997试化疗生白血病rSK医大实业1996试心梗溶栓rhuEPO华欣永铭维沃1997试1997试再生障碍性贫血再生障碍性贫血bFGF（外用）珠海东大1996试创伤，烧伤一、基因工程与医药卫生1、生产基因工程药品

（1）传统的某些药品（如动物激素）生产：控制某种物质合成基因转基因“工程菌”基因工程药品基因表达产物基因工程发酵分离提取从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。（3）基因工程生产的药品重组人生长激素重组人白细胞介素重组人干扰素重组人胰岛素发酵罐（2）基因工程方法生产药品的方法：151二、基因工程菌大肠杆菌表达系统一：大肠杆菌表达外源基因的优势二大肠杆菌表达载体的基本组成三常用的大肠杆菌表达载体四真核基因在大肠杆菌中的表达五大肠杆菌表达真核基因存在的问题六基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制七.人胰岛素的生产方法一：大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)periplasmheterogous二大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：有抗菌素抗性基因决定载体拷贝数的复制起点(ori)供外源基因插入的多克隆位点。参与控制转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达,它的编码结构必须是连续的,不间断的,处于寄主启动子有效控制下。1启动子可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1)强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上2)应能呈现出一种低限的基础转录水平3)应该是诱导型的,能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。Accountforinducibleb:如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子,那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。2终止子

a

:如果在克隆基因编码区的3

末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子

c:转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性,大大提高蛋白质产物水平。在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子,阻止核糖体跳跃(skipping)现象。大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA,当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下,转译终止效率便会得到进一步加强。3转译起始序列mRNA的5

末端之独特的结构特征,是决定mRNA转译起始效率的主要因素。在构建外源基因的高效表达载体时,需认真选择有效的转录起始序列。未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构initiationfactorconservedsequenceuniversial4、reportergene其编码产物可被快速测定的功能单元。追踪某些特定的DNA结构(重组质粒)是否已经导入寄主细胞同任何一种目的启动子连接,其表达活性可作为检测启动子功能的依据。usageβ－半乳糖苷酶基因lacZ、碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因(cat)四环素抗性基因(tetr)alkalinephosphatase三常用的大肠杆菌表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体启动子λ噬菌体的PL启动子大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子色氨酸操纵子trp启动子pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子LactoseOperon图1-1在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号启动子核糖体结合位点基因终止子DNARNA转录核糖体结合mRNA位点图1-2基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPu>Py-35区-30-70正调控区-20负调控区+1-10区GC区….CAAT区TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增强子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核图1-3通过表达载体在大肠杆菌中被表达PRTTPRTPRmRNA蛋白质表达载体外源基因将外源基因插入限制性酶切位点转化大肠杆菌图1-4杂交基因的构建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因｝ATATTA正确融合N端C端不正确融合外源基因不被翻译表达ATATTA

GGAGCTGGAGC融合蛋白亲和层析法纯化化学试剂除去大肠杆菌肽段图1-5在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题翻译转录PRTT转录大肠杆菌不能切除内含子转录提前终止图1-6真核细胞表达载体常用的4种启动子P半乳糖转录GAL10P甲醇转录乙醇氧化酶基因（a）GAL启动子（b）AOX启动子（c）葡萄糖水解酶启动子（d）纤维二糖水解酶启动子P纤维素转录纤维素二糖水解酶基因P淀粉转录葡萄糖淀粉酶基因木糖不转录四真核基因在大肠杆菌中的表达三种表达部位各有不同的优缺点//

而且对克隆基因表达产物的制备有很大关系。在细胞质中表达在细胞周质中表达以分泌到细胞外的形式表达。1外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置cytoplasmperiplasm1)细胞质中表达expressedincytoplasm包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。在表达中应尽可能限制包含体产生,并促进形成天然三维结构的蛋白质。多采用与分子伴侣共表达的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折叠能力的一种有效途径。insolublechaperon周质:指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。在大肠杆菌中,已成功的使用了各种不同类型信号肽,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。周质中表达外源蛋白质优点:A:周质中蛋白质种类少,周质中表达的外源蛋白质能够被有效的浓缩和纯化。b:周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠c:在周质中蛋白质降解不广泛。来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有效表达。2)周质中表达expressedin

periplasm3)分泌表达使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化,这种研究思路称为外源蛋白质的分泌表达。目的蛋白稳定性高:目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整将外源基因与大肠杆菌信号肽编码序列重组在一起进行分泌表达,其N端的甲硫氨酸残基可在信号肽剪切过程中被有效除去这些真核基因在大肠杆菌中表达时,蛋白质甲硫氨酸残基往往不能被切除。分泌表达优点

:重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中,其稳定性大约是在细胞质中的10倍许多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸残基。intactexcise外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达;外源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多分泌表达缺点相对其它生物细胞,大肠杆菌蛋白分泌机制不健全。目前产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌工程菌很少Perfectsound分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象，对蛋白酶不敏感蛋白质的分泌机制原核细胞周质中有多种分子伴侣,可阻止分泌蛋白随机折叠分泌至细胞周质或培养基中重组蛋白很少形成分子间二硫键与包涵体相比randomSulferinnerouter重组大肠杆菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表达系统构建有些G-能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白

,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶,导致细菌内外膜的通透性增大。将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化受体细胞完全分泌型受体细胞转化permeabilitybacteriocin二种类型由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成。用于生产新型融和蛋白。2融和蛋白质表达将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起,并作为一个开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。

2.1融和基因attention外源基因应装在受体蛋白编码基因下游,为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下,并不需要完整的受体结构基因2.2融和蛋白的表达策略融合蛋白表达质粒的构建原则受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要,它直接决定融合蛋白的裂解。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架在DNA水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点,可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白Baseonconsistent使克隆外源基因有效转译有效转译：取决于核糖体的结合位点,

受到编码区起点核苷酸序列影响。可使蛋白质产物稳定,免受寄主胞内酶的降解作用,因此可以得到较高的产率。可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置。能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。2.3表达融合蛋白质的优点ribosome3整合型异源蛋白的表达工程菌在没有选择压力存在下,可以连续培养而不丢失目的基因表达盒,

这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程特别有意义3.1整合形式表达目的蛋白的特点目的基因稳定表达目的基因表达率低整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA一起复制,

在大多数情况下相当稳定单拷贝整合的目的基因表达率受到限制,此时可通过强化表达元件加以补偿replicate/stabilitySpecies/improvementintensify转位因子依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组3.2DNA体内重组的基本原理生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子,不同生物种群拥有结构不同的转位因子噬菌体G片段(G-Fragment)原核微生物插入顺序(IS)真核微生物转座子(Tn、Ty)高等植物可移动因子(Ac、Ds)高等动物跳跃基因(mobilegene)转位因子transposon转位因子依赖型的体内重组转位因子的结构transposonpalindromerepressorinversionregion整合形式

同源整合同源序列依赖型的体内重组同源整合一般地说,距离越远、长度越长、同源性越高,重组的频率也就越高,反之亦然。同源整合1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制；五大肠杆菌表达真核基因存在的问题2转录信号不同。真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列。细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子3mRNA的分子结构有所差异。绝大多数真核mRNA分子的3

末端有poly(A)尾巴，在5

末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力，阻止正常的转录和转译。4真核生物的蛋白质有些是通过前体分子加工来的。在细菌中不存在这种修饰作用。5细菌的蛋白酶可以识别和降解真核生物的蛋白质产物结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失六基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制1工程菌遗传不稳定性表现形式基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性,具有下列两种表现形式分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸segregativeinstabilitydomainDeletionregionrearrange受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解2工程菌遗传不稳定性的产生机制外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应，关闭合成途径，启动降解重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排Deletion以构建稳定性高质粒:

将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中:其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞3改进载体、受体系