牙周膜干细胞的研究进展-0

牙周膜干细胞的研究进展牙周组织工程是牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞是其关键种子细胞之一。本文就牙周组织工程的相关研究和牙周膜干细胞的来源、分离与培养、细胞表型、生物学特性、功能影响因素和分子调控进行综述，并对其面临的挑战和前景作一讨论。标签：牙周组织工程；牙周膜干细胞；挑战；展望ResearchprogressonperiodontalligamentstemcellsDongZhengmou1，2,LiuLuchuan1.（1.Dept.ofStomatology,InstituteofFieldSurgery,DapingHospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China;2.Dept.ofStomatology,People’sHospitalofHongan,Huanggang438400,China）[Abstract]Theperiodontaltissueengineeringhasbeenastrikingresearchonthetreatmentofperiodontaldis－ease,andtheperiodontalligamentstemcellisoneofthekeyseedcellsontheperiodontaltissueengineering.Inthisstudy,arelatedresearchonperiodontaltissueengineering,andthesource,isolatedandcultured,cellpheno－type,biologicalcharacteristics,influentialfactoroffunction,molecularregulationontheperiodontalligamentstemcellswouldbereviewed,meanwhilethechallengesandprospectsonitwouldbediscussed.[Keywords]periodontaltissueengineering；periodontalligamentstemcell；challenge；prospect牙周病是人类口腔疾病中的常见病和多发病，常导致牙周支持组织破坏或缺损，严重影响人类的生理和心理健康。目前，牙周支持组织重建主要依赖机械、药物或引导组织再生技术，随着分子生物学、组织工程学和干细胞技术的飞速发展，牙周组织再生工程技术成为牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞（periodontalligamentstemcell，PDLSC）是牙周组织再生工程的关键种子细胞之一，本文就其研究现状和进展作一综述。1牙周组织工程学牙周组织工程学是将获得的种子细胞和或调控因子种植于具有良好生物相容性和降解性的支架材料上，并将这种生物复合体植入牙周组织以形成新的具有原来特殊形态和功能组织的技术和方法，为牙周病的治疗研究开辟了新的思路。1.1牙周组织工程的种子细胞种子细胞是牙周组织再生工程的基础。牙周膜细胞（periodontalligamentcell，PDLC）分化、增殖能力较强，是常用的牙周组织工程种子细胞[1]；牙龈成纤维细胞、成牙骨质细胞、胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）[2]、牙胚细胞、成体干细胞、骨髓基质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcell，BMSC）[3]、脂肪干细胞等在一定条件下均可成为牙周组织工程的种子细胞。PDLSC不仅能分化为成牙骨质细胞样和成骨细胞样细胞，而且可分化为成纤维样细胞，形成牙骨质样、骨样和类似天然牙周膜样结缔组织，其形态结构、空间排列类似天然牙周膜-牙骨质复合体结构[4]，显示了PDLSC作为牙周组织工程种子细胞的研究和应用价值，是牙周组织工程较为理想的种子细胞。1.2生物支架材料生物支架模拟细胞外基质，为组织、器官再生提供一个良好的微环境。目前，相关支架材料的研究主要有羟磷灰石类、胶原、合成聚酯和复合型材料。天然衍生型羟磷灰石的骨小梁和晶体结构有利于细胞生长、分化和矿化形成；胶原可保持细胞表型与生物活性，具有良好的可塑性和生物相容性；合成聚酯如聚羟基乙酸、聚乳酸和聚乳酸聚羟基乙酸等材料可预设成形，并可自由调控其强度和降解率；复合型材料结合有机、无机材料的优点，有望更适合细胞生长。1.3调控因子调控因子可影响细胞分化、增殖、迁移、黏附和胞外基质的合成，能促进牙周组织再生和修复。目前，与牙周组织再生相关的生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）、骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）、釉基质蛋白、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β和Wnt基因家族等[5]。2来源、分离和培养PDLSC主要来源于牙周膜的成体干细胞，用组织块法、酶消化法或二者联合的方法处理牙周膜可获得前体干细胞，再利用免疫磁珠法、有限元稀释法和流式细胞分离技术可得到PDLSC，进行单克隆扩增即可获高纯度PDLSC[1，6]。免疫磁珠和流式细胞分离技术分离PDLSC速度较快，但细胞获得率较低；有限稀释法步骤烦琐，速度慢，细胞克隆率较高。免疫磁珠法和流式细胞分离技术仍然是目前公认的有效的分离方法。PDLSC可使用含胎牛血清、维生素C、L-谷胺酰胺、青霉素、链霉素的达尔贝科极限培养液，在37℃，5%CO2孵箱内培养；也可在含20μg·L-1表皮生长因子、50μg·L-1的bFGF、10μg·L-1白血病抑制因子的神经微球形成培养系统中培养；Yang等[6]利用发育中的根尖牙胚培养液与PDLSC共培养，发现此种培养液可促进PDLSC的分化和牙骨质形成。3生物学表型目前PDLSC缺乏特异性标记物，只能从相关生物学特性上进行鉴定：如表达间充质干细胞标志物、腱细胞标志物和BMSC表面标志物等。Seo等[7]利用免疫组织化学、反转录-聚合酶链反应、RNA印迹和蛋白质印迹等方法研究后发现，PDLC表达间充质干细胞表面分子Stro-1、细胞黏附分子CD146和细胞跨膜糖蛋白18。Trubiani等[8]利用流式细胞分离法、免疫磁珠分离法、抗体微阵列技术和免疫荧光技术等方法研究后发现，PDLSC表达间质细胞标志物细胞黏附分子CD349，ESC标志物细胞黏附分子CD10、CD26、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，阶段特异性胚胎表面抗原-1、4，转录因子Oct-4和Nanog，同时表达表皮细胞生长因子和干扰素诱导蛋白-10，其中间充质干细胞表面分子基质细胞抗原-1、细胞黏附分子CD146、CD105和CD166是公认的鉴定PDLSC的特异性标记物。另外，细胞形态、超微结构及动力学特性也是鉴定PDLSC的重要方面，PDLSC常位于小血管周围，体积小，圆形、卵圆或多角形，超微结构上核浆比例低，细胞器少，而且细胞处于G0期，保持静止状态[9]。4生物学特性4.1多向分化潜能在特定培养环境诱导下，PDLSC具有多向分化潜能，具有分化成成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞、胶原细胞和软骨细胞的能力。将PDLSC用0.5mmol·L-1异丁基甲基黄嘌呤、0.5molL-1氢化可的松、60mol·L-1吲哚美辛诱导6周后，可检测到脂肪细胞特异性油红O脂滴，反转录-聚合酶链反应检测发现，特异性核转录因子———过氧化物酶增生物激活受体γ2表达上调[7]。PDLSC还可表达神经前体细胞和神经胶质细胞标志巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白，表明PDLSC具有向神经细胞分化的潜能。4.2高度增殖能力细胞周期是细胞增殖的重要指标之一，大多数PDLSC处于G0/G1期，即静止期和DNA合成前期，G2、S期细胞数目较少，表明其克隆增殖潜能较大。PDLSC在体内具有高度克隆形成能力，在体外同样具有较好的增殖能力，在化学条件下诱导PDLSC，可保持其较高的增殖与黏附能力[10]。4.3自我更新能力PDLSC、牙髓干细胞、脱落乳牙和牙囊干细胞等都具有自我更新的能力[11]。将分离扩增的PDLSC在含有无机磷酸盐、地塞米松、L-抗坏血酸等矿化诱导液中培养，经细胞茜素红染色后可观察到有钙结节的形成，这证实了PDLSC具有自我更新的能力[7]。5影响因素PDLSC是新近发现的成体干细胞，具有多向分化、高度增殖和自我更新的潜能，但这些功能也受多种因素的影响。5.1牙周微环境不同微环境下的PDLSC可表现出不同的潜能。牙本质和根尖微环境对PDLSC分化具有诱导作用，经牙本质非胶原蛋白（dentinnoncollagenousprotein，DNCP）诱导的PDLSC增殖和黏附能力增强，可形成特异矿化组织和穿通纤维结构；由上皮和间充质复合体培养液诱导的PDLSC则表现出较强的增殖和矿化活性，可形成纤维-牙骨质复合体结构[6]。5.2炎症与免疫因素炎性因子干扰了细胞赖以生存的微环境，影响细胞代谢和功能，炎症在某些情况下可促进PDLSC的增殖活动，但同时又可抑制其向特定细胞分化的能力；虽然PDLSC有很强的分化克隆能力，但其数量常常产生不足，部分原因可能在于免疫损伤的作用[12]。5.3冷藏保存体外获得稳定生物学性状的PDLSC是其用于牙周组织工程的先决条件，若在活力最佳时期及时冻存种子细胞，则可简化PDLSC在牙周组织工程的研究步骤。Seo等[13]研究冷藏PDLSC后发现，在一定温度下可以保持PDLSC的各种生物学特性，包括单克隆特性、多分化潜能和牙骨质、牙周膜形成能力等。5.4年龄因素随着年龄的增长，PDLC的增殖和矿化能力下降，胶原分泌减少、降解酶活性升高；同样，老年个体PDLSC也可出现增殖和矿化能力下降的趋势。Zheng等[14]通过比较不同年龄PDLSC的增殖和分化能力，包括形态学、克隆率、细胞周期、成骨成脂能力和相关基因表达，发现随着年龄的增长，上述指标均出现了功能下降的趋势。6分子调控机制目前，有关PDLSC分子调控机制的研究较少，尚处于起始阶段。Klein等[15]将人牙周膜干细胞（humanperiodontalligamentstemcell，HPDLSC）和DNCP一起培养，观察发现，HPDLSC表现出了成牙骨质特性，经DNCP诱导的HPDLSC在去矿化、去蛋白后，在牙本质表面有较强的分化增殖能力和黏附能力。有研究将大肠埃希菌表达的BMP重组体与PDLSC一起用于牙周组织再生，经体内、外研究已证实，重组的BMP具有促进PDLSC形成牙骨质、牙周纤维和骨的能力。Wnt基因家族是动物发育的重要信号分子，在细胞极性化、增殖和凋亡中扮演重要角色，经典Wnt通路主要通过链接素β-连环蛋白在核中累积，启动Wnt相关靶基因表达，调控细胞增殖和分化；Wnt信号肽有促进基质干细胞和成骨细胞成骨的作用，Wnt3使细胞周期素D1表达增加，通过选择转录作用抑制成骨细胞分化、促进细胞增殖[16]；研究还发现细胞黏附分子CD349在调节牙周膜基质干细胞分化方面起着重要作用。这些发现从机制上初步揭示了PDLSC增殖与分化的关键调控分子，为将来利用信号通路调控PDLSC再生牙周组织提供了实验依据。7问题及展望目前，PDLSC研究尚处于初级阶段，还有许多问题亟待解决：1）种子细胞来源困难，易受环境、炎症、免疫和年龄等因素的影响；2）分离、纯化与鉴别技术尚不成熟，获得PDLSC数量较少，且随着传代增加，其分化、增殖能力下降，限制PDLSC在牙周组织工程进一步应用；3）牙周组织形成是一个非常复杂的三维过程，PDLSC在有限的时间内形成正常结构和功能的牙周组织尚需要一个漫长的过程；4）在某些情况下如基因缺陷、DNA变异导致自体干细胞缺陷不能作为干细胞来源，就必须面临异体移植引起的异质性问题[15]；5）PDLSC具有多向分化潜能和高度增殖能力，但尚不能控制其形成特定目的细胞，有导致畸胎瘤的危险，同时异体移植还可能引起传染性疾病；6）干细胞技术一直存在着道德伦理争议。随着科学技术迅猛发展，人们可对目的干细胞进行定向诱导和分化，并可进行基因修饰，为组织再生、置换和替代治疗开辟了一条新途径，PDLSC研究将为牙周组织工程开辟更为广阔的应用前景：PDLSC将作为牙周组织工程的种子细胞构建组织工程化牙周膜；应用于种植体－骨组织界面，使其成为真正意义上的牙周结缔组织；与牙髓干细胞及其他细胞一起联合构建组织工程化牙根甚至完整的牙齿结构。8参考文献[1]WashioK,IwataT,MizutaniM,etal.Assessmentofcellsheetsderivedfromhumanperiodontalligamentcells：Apre-clinicalstudy[J].CellTissueRes,2010,341（3）：397-404.[2]Inan觭B,El觭inAE,El觭inYM.Invitrodifferentiationandattachmentofhumanembryonicstemcellsonperiodontaltoothrootsurfaces[J].TissueEngPartA,2009,15（11）：3427-3435.[3]PengL,YeL,ZhouXD.Mesenchymalstemcellsandtoothengineering[J].IntJOralSci,2009,1（1）：6-12.[4]GayIC,ChenS,MacDougallM.Isolationandcharacterizationofmultipotenthumanperiodontalligamentstemcells[J].OrthodCraniofacRes,2007,10（3）：149-160.[5]LiuL,LingJ,WeiX,etal.Stemcellregulatorygeneexpressioninhumanadultdentalpulpandperiodontalligamentcellsundergoingodontogenic/osteogenicdifferentiation[J].JEndod,2009,35（10）：1368-1376.[6]YangZH,ZhangXJ,DangNN,etal.Apicaltoothgermcell-conditionedmediumenhancesthedifferentiationofperiodontalligamentstemcellsintocementum/periodontalligament-liketissues[J].JPeriodontalRes,2009,44（2）：199-210.[7]SeoBM,MiuraM,GronthosS,etal.Investigationofmultipotentpostnatalstemcellsfromhumanperiodontalligament[J].Lancet,2004,364（9429）：149-155.[8]TrubianiO,ZalzalSF,PaganelliR,etal.Expressionprofileoftheembryonicmarkersnanog,OCT-4,SSEA-1,SSEA-4,andfrizzled-9receptorinhumanperiodontalligamentmesenchymalstemcells[J].JCellPhysiol,2010,225（1）：123-131.[9]NagatomoK,KomakiM,SekiyaI,etal.Stemcellpro-pertiesofhumanperiodontalligamentcells[J].JPeriodontalRes,2006,41（4）：303-310.[10]MaZ,LiS,SongY,etal.Thebiologicaleffectofdentinnoncollagenousproteins（DNCPs）onthehumanperiodontalligamentstemcells（HPDLSCs）invitroandinvivo[J].TissueEngPartA,2008,14（12）：2059-2068.[11]HuangGT,GronthosS,ShiS.Mesenchymalstemcellsderivedfromdentaltissuesvs.thosefromothersources：Theirbiologyandroleinregenerativemedicine[J].JDentRes,2009,88（9）：792-806.[12]WadaN,MenicaninD,ShiS,etal.Immunomodulator