TCSBM 0050.4-2024 创面修复材料有效性评价 第4部分：体外微血管形成试验评价方法

T/CSBMT/CSBM0050.4—2024创面修复材料有效性评价第4部分：体外微血管形成试验评价方法EffectivenessevaluationofwoundrepairmaterialsPart3:Invitromicroangiogenesisevaluationmethod中国生物材料学会发布I 3 4本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起本文件起草单位：杭州英健生物科技有限公司、中国食品药品检定1本文件适用于适用于创面修复材料促进创面微血2规范性引用文件T/CSBM0050.1—2024创面修复材料有效性评价第1部分：水溶性T/CSBM0050.2—2024创面修复材料有效性评价第2部分：水不溶性材料4样品制备5血管形成试验25.2.1器具m)基质胶；5.2.2试剂和耗材b)磷酸缓冲液（PBS5.2.3细胞系5.3.1试验样品5.3.2空白对照MEM低糖培养基，37℃、120r/min摇床中震荡24h。5.4.1.1细胞复苏将EA.HY926细胞冻存管于37℃恒温水浴锅内不断晃动，待细胞冻存液完全溶解，将冻存的细胞悬液转移至15mL离心管内，随后加入MEM低糖培养基，用无菌巴氏吸管吹打均匀后1000r/min离心3min。5.4.1.2细胞传代3当细胞密度约为80％时，吸去培养瓶中原有的培养基，使用PBS轻洗两次，加入1mL～2mL0.25%胰蛋白酶消化3min～5min，显微镜观察细胞消化情况，当细胞边缘缩小，贴壁松动时，手指轻叩细胞瓶身，肉眼可见细胞脱落，向培养瓶内加入一定量的MEM低糖培养基终5mLMEM低糖培养基，将细胞重新混悬，取适量混匀的细胞悬液于细胞培养箱中继续培养。传代比例为1：4，2天～3天5.4.1.3细胞冻存然后将混匀的细胞悬液放入冻存管中，每管1mL，冻存密度为1×105/mL～1×106/mL。冻存管上应标明5.4.2小管形成试验d)待细胞融合至80％左右时，将细胞消化、离心并分别用试验液和空白对照小管形成试验结果：在观察时间内血管形成情况的描述，并免疫荧光染色结果：评价血管网形成的数量和血管形成的总长度，采用统计学评价方法，料促进血管形成的效果，并给出免疫荧光染色的结果图片。经统计学分析试验组和空白对照组比较p<4A.1器具、试剂和耗材、细胞系A.2.1浸提液制备A.2.2空白对照5MEM低糖培养基，37℃、120r/min摇床中震荡24h±2h。A.3试验步骤A.3.1EA.HY926细胞培养按5.4.1进行。A.3.2小管形成试验按5.4.2进行。A.4血管形成试验结果A.4.1小管形成试验结果各组细胞分别加入处理后的样品重悬，随后接种到铺板基质胶的24孔板中培养9h,观察各组血管结构在不同时间的的生成情况。细胞刚接种时大多呈圆形，随着培养时间的延长，细胞开始长出伪足，与相邻细胞相连；3h时，部分细胞由圆形伸展为长梭形，部分细胞间逐渐建立连接；6h时，细胞多数于周围细胞建立连接，线样结构增多且细胞逐渐形成管状网格结构；随着时间的延长，形成的线样结构逐渐断裂，细胞逐渐聚集，小管样结构数量减少。×100显微镜下不同时间小管形成情况见图A.1。样品组图A.1×100显微镜下不同时间小管形成情况A.4.2免疫荧光染色结果管状形成反映了人脐静脉内皮细胞的体外小管形成能力，样品浸提液与对照组相