核算杂交技术聚合酶链反应

核算杂交技术聚合酶链反应基本原理核酸由许多核苷酸聚合成得生物大分子化合物,为生命得最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同得核酸,其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同,核酸可分为核糖核酸,简称RNA;和脱氧核糖核酸,简称DNA。DNA就是储存、复制和传递遗传信息得主要物质基础,RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用,其中转移核糖核酸,简称tRNA,起着携带和转移活化氨基酸得作用;信使核糖核酸,简称mRNA,就是合成蛋白质得模板;核糖体得核糖核酸,简称rRNA,就是细胞合成蛋白质得主要场所。核酸得结构与特征核酸得结构一级结构:核苷酸以3’,5’磷酸二酯键构成无分支结构得线性分子二级结构:双螺旋结构或局部双链三级结构:超螺旋结构四级结构:DNA与蛋白质形成复合物核算得结构与特征核酸得特性核酸得变性作用爆发式Tm值核酸得复性作用骤然冷却缓慢冷却核酸得杂交在适宜得条件下,将不同来源得DNA放在试管里,经热变形后,慢慢冷却,让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同得序列,则可以通过互补碱基多之间非共价键(氢键)得作用,形成稳定得双链区,即复性形成杂交DNA探针(probe):利用标记分子对其她分子得识别性而实现对后者进行检测得一种技术,通常把标记得分子叫探针探针技术与核酸分子杂交技术相结合核算杂交得方法固相杂交固相支持物应具备得特征:1、具有较强得结合核酸分子得能力2、与核酸分子结合后,应不影响其与探针分子得杂交反应3、与核酸分子得结合稳定牢固,能经受杂交、洗膜等操作过程而不至于脱落或脱落很少4、非特异性吸附少,在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面得探针分子洗脱掉5、具有良好得机械性能固相杂交类型:Southern印记、Northern印记、组织原位杂交、菌落原位杂交等液相杂交核酸探针得制备概述核酸探针以研究和诊断为目得,用来检测特定序列核算得DNA或RNA片段。核酸探针得种类DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针优点缺点大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静核酸探针得标记和检测放射性标记

32P和35S切口移位法随机引物延伸标记法末端标记法125I标记RNA和DNA非放射性标记生物素、洋地黄毒苷配体-dUTP、辣根过氧化物、碱化基团半抗原、荧光素、化学发光剂、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶间接标记法直接标记法DNA探针得吖啶酯标记Southern印迹杂交概述Southernblotting将待测核酸分子通过一定得方法转移并结合到一定得固相支持物上,即印迹固定于膜上得核酸同标记得探针在一定得温度和离子强度下退火(复性),即分子杂交过程Southernblotting待测核算样品得制备与限制酶消化采集样本、提取DNA基因组DNA很长,通常用限制性酶消化Southernblotting琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品目得:按片断长短进行分离,确定杂交靶分子得大小琼脂糖凝胶浓度得选择电泳,EB染色,紫外灯观察凝胶Southernblotting电泳凝胶得预处理为了使DNA片段在合理得时间内从凝胶中移动出来,必须将最长得DNA片段控制在大约2kb一下0、25mol/LHCl短暂脱嘌呤,碱液浸泡,使DNA变性病断裂形成较短得单链DNA片段,用中性pH得缓冲液中和凝胶中得缓冲液,然后在20×SSC中平衡凝胶10minSouthernblotting转膜常用固相支持物:NC膜和Nylon膜常用转膜方法:细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法等Southernblotting探针标记预杂交与Southern杂交将膜上所能与DNA结合得位点全部封闭,即预杂交得目得;预杂交后杂交2×SSC淋洗膜后置于合适得容器中并加入10ml左右得预杂交溶液,65℃转动或摇动3-4h;煮沸探针5-10min使其变性,立即加入65℃预热得杂交液;倒去预杂交液并加完成得杂交液,65℃转动或摇动过夜Southernblotting洗膜采用核素标记得探针或发光剂标记得探针进行杂交得关键一步放射性自显影检测X线底片曝光与洗片Southernblotting注意事项Northern杂交技术实验原理:

Northern杂交就是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA得技术。其基本原理和程序与Southern杂交类似,基本过程包括RNA得提取,琼脂糖凝胶电泳分离,将变性得RNA从凝胶向滤膜转移,然后与滤膜结合,最后用标记探针对固定在膜上得RNA进行杂交,用放射自显影等方法显示与标记探针序列互补得目得条带。

由于RNA极易降解,而RNA酶不仅无处不在,而且很难消除,所以在操作过程中必须采取必要得措施,包括使用专门准备得用具、试剂和溶液等,所有溶液尽量用DEPC处理后高压消毒得高质量去离子水制备。由于手汗含有大量得RNA酶,因此操作人员必须戴防护手套。实验步骤:

1、进行RNA琼脂糖凝胶电泳

2、RNA变性

3、将RNA转移到尼龙膜上

4、使RNA与尼龙膜结合

5、RNA与探针杂交

6、洗去非结合探针

7、放射自显影显示与标记探针序列互补得目得条带

变性:由于RNA直接与尼龙膜结合力差,且具有茎环结构,必须将RNA先经变性剂(甲醛/羟甲基汞/戊二醛)处理,一方面使RNA变性,另一方面可促进RNA与滤膜有效结合。注意:RNA变性与DNA变性方法不同,不能用碱变性,否则易引起RNA水解。

转移:用刀片修饰凝胶,弃去不需要部分和加样孔以上部分,并在一角切成三角形缺口以做记号。剪取一张略大得尼龙膜,一角剪成与凝胶缺口同样大小得三角形缺口,将膜漂浮在一盘去离子水表面,待完全侵湿后在10倍SSC中侵泡至少5min。转膜有两种方法:电转移法和毛细管转移法毛细管转移法图示:

电转移法图示:

取出尼龙膜,甩掉多余液体,将有RNA得一面朝上,在滤纸上晾几分钟。将尼龙膜晾干后,夹在两滤纸之间,在真空烘烤箱中80℃烘烤2h。杂交将放射性同位素标记得DNA探针经100℃煮沸5min和冰浴2min变性,然后将探针和膜放入袋中杂交,在68℃水浴中杂交过夜。

杂交结束后,将尼龙膜在一定量得0、1%SDS-1倍SSC中室温下轻轻摇动洗涤10min,然后在一定量得预热至68℃得0、1%SDS-0、5倍SSC中洗涤3次。

注意事项:

1、EB会影响RNA与尼龙膜得结合,所以在胶中不能加核酸染料EB。

2、实验所用得器具、试剂以及实验环境一定要防止RNase得污染。

3、所有用于Noethern印迹得溶液均需用DEPC处理后高压消毒得高质量去离子水制备。

4、操作人员必须戴防护手套和口罩,防止RNase污染和操作人员吸入DEPC中毒。聚合酶链反应基因扩增(geneamplification)——

指生物体内或体外基因拷贝数大规模增加。PCR扩增:应用聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术,在体外酶促合成特异DNA片段得一种方法。基因扩增技术---PCRDNA得复制(1)3’-OH进攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA得延伸方向:5‘->3’DNA得复制(2)DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNADNA得复制(3)PCR技术得创建

KaryB、Mullis(穆利斯(美))Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA得设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana得设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术。1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。故事发生在1983年

得春夏之交KaryB、Mullis(1944-),在Cetus公司工作期间,发明了PCR。她原本就是要合成DNA引物来进行测序工作,却常为没有足够多得模板DNA而烦恼。1983年春夏之交得一个晚上,她开车去乡下别墅得路上萌发了用两个引物(而不就是一个引物)去扩增模板DNA得想法…、、、很少有在公司工作得科研人员得

诺贝尔奖,Mullis就是其中之一Mullis开车得时候,瞬间感觉两排路灯就就是DNA得两条链,自己得车和对面开来得车象就是DNA聚合酶,面对面地合成着DNA……Mullis得第一个PCR实验1983年9月中旬,

Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于就是她认识到有必要用加热来解链,每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应,依次循环。1983年12月,她终于看到了被同位素标记得PCR条带。94℃55℃37℃基本原理PCR就是一种体外酶促合成特异DNA片段得新方法她由一对引物介导,与模板DNA特异结合,选择性地扩增特异得DNA片段反应体系包括:DNA靶序列、引物、四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、耐热DNA聚合酶、合适得缓冲液体系PCR技术得三步反应PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环—退火PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR整个过程PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点50℃引物1引物2DNA引物PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点

第1轮结束第2轮开始95℃PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点72℃TaqTaqTaqTaqPCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点第2轮结束PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR得技术路线PCR得基本步骤体系(加样方法)

10×PCR缓冲液10ulDNA模板0、1-1ugdNTP(2mmol/L)各10ul

两种引物(10-50umol/L)各1-2ulddH2O(灭菌)加至100ul

离心15s,加石蜡PCR得基本步骤PCR循环预变性97℃,2-5min,迅速冷却至室温加入TaqDNA聚合酶主循环变性94℃30-60s

退火55℃30-60s

延伸72℃60-150s

循环25-35次终延伸72℃5-10minPCR得反应体系及其优化概述模板引物缓冲体系一价或二价阳离子四种dNTP耐热DNA聚合酶模板模板得纯化模板DNA片段大小适宜得模板量引物

引物:决定PCR反应得特异性

PCR产物得特异性取决于引物与模板DNA互补得程度理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补得寡核苷酸链做引物,用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增

基本原则就是最大限度地提高扩增效率和特异性,同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计得原则引物引物得长度引物得扩增跨度引物得组成引物3‘端配对引物得浓度①引物长度:15-30bp,常用20bp左右—引物得有效长度不能大于38bp,否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶得最适温度(74℃),不能保证PCR扩增产物得特异性②引物扩增跨度:以500bp为宜—特定条件下可扩增长至10kb得片段③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜

—G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带

—ATGC最好随机分布,避免5个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列,尤其3′端不应超过3个连续得G或C,因为这样会使引物在G+C富集区引发错误延伸④避免引物内部出现二级结构和引物间互补

—特别避免3’端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异性得扩增条带⑤引物3’端得碱基要求严格配对(不能做任何修饰)—特别就是最末及倒数第二个碱基,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物5′端可修饰

—引物5′端限定着PCR产物得长度,但对扩增特异性影响不大;引物5′端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态;引物5′端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响

⑦引物得特异性:—引物应与核酸序列数据库得其她序列无明显同源性⑧引物量:—每条引物得浓度0、1~0、5μM,以最低引物量产生所需要得结果为好—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体得机会技术举例耐热DNA聚合酶目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶:从水生嗜热杆菌中提纯基因工程酶:大肠菌合成一个典型得PCR反应约需酶量1-2、5U/100ul体系浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶得功能TaqDNA聚合酶得特性TaqDNA聚合酶得使用量TaqDNA聚合酶得影响因素三磷酸脱氧核苷酸在PCR反应中,dNTP应为50～200μM,浓度过低会降低PCR产物得产量注意4种dNTP得浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其她几