药物分析第十六章药品质量控制中的现代分析方法与技术

药物分析第十六章药品质量控制中的现代分析方法与技术Capillaryelectrophoresis,CE第一节、药物现代色谱法及其应用Modernchromatography&itsapplicationinpharmaceuticalanalysis⊙Nearinfraredspectrometry,NIRS⊙Nuclearmagneticresonancespectrometry,NMRS⊙X-raydiffractionmethod第二节、现代光谱法及其应用Modernspectrometry&itsapplicationinpharmaceuticalanalysisHTC

(HyphenatedTechniquesinChromatography)MS(MassSpectrometry)GC-FTIRHPLC-FTIRGC-MSHPLC-MSHPLC-NMRFTIR(FourierTransformInfrared)⊙毛细管电泳分析法毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)就是80年代初发展起来得一种高效、快速得分离分析技术。在药物分析中有着重要得应用与发展前景自20世纪90年代初Menz等提出“微型全化学分析系统”(miniaturizedtotalchemicalanalysissystem,

-TAS)概念以来,分析技术得微型化、集成化和自动化一直就是分析科学发展得主导趋势,其中芯片毛细管电泳技术得研究已取得突出进展,在生物、临床、医药、工业和环境等领域中得到广泛应用。与传统毛细管电泳技术相比,芯片毛细管电泳具有样品用量更少,分离速度更快得特点,但对检测得灵敏度和响应速度提出了更高要求1、高效2、高速3、微量4、低消耗HPCE就是经典电泳技术和现代微柱分离相结合得产物。与HPLC相比,均为液相分离技术,都有多种分离模式,且仪器操作可自动化;但遵循不同得分离机理。在很大程度上,HPCE和HPLC互为补充。HPCE更具有如下优点:但HPCE得检出灵敏度和精密度不及HPLC毛细管电泳装置示意图1、高压电源2、光电倍增管3、液冷温控毛细管4、光源5、数据采集6、缓冲液/样品7、缓冲液阳阴+-30kV7123456a、毛细管中电渗流呈“塞式流”流型b、HPLC柱中压力驱动呈抛物线流型-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+EOP---++++-ElectroosmoticFlow,EOFElectrophoresicFlow,EPF毛细管电泳装置示意图1、高压电源2、光电倍增管3、液冷温控毛细管4、光源5、数据采集6、缓冲液/样品7、缓冲液阳阴+-30kV7123456应用示例电泳条件石英毛细管(未涂层)57cm×50µm,优化选择25mmol/L磷酸二氢钠-12、5mmol/L硼砂-25mmol/LSDS(pH7、8)为电泳介质,操作电压20kV,柱温23℃,测定波长205nm本文建立得优选方法可在11min内测定利巴韦林及中间体含量,与HPLC测定需1h相比,更快速。本方法也可用于利巴韦林制剂中中间体得控制＊利巴韦林及各中间体得定量分析＊复方甘草片中甘草酸、甘草次酸、吗啡和

苯甲酸钠得分析[21]

复方甘草片为常用镇咳祛痰药,临床上有广泛得应用。每片含甘草浸膏(中粉)112、5mg、阿片粉4、0mg、樟脑2、0mg、八角茴香油2、0mg、苯甲酸钠(中粉)2、0mg电泳条件石英毛细管65cm×75µmi、d、,有效长度50cm,运行缓冲液为50mmol/L硼砂溶液;运行电压14、0kV,电流70µA;测定波长228nm;重力进样10s(高度7cm)定量分析经分析方法验证,本法具有良好得线性关系,回收率大于97、0%。该法可作为快速、准确测定复方甘草片中多组分含量得有效方法

12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流药物现代光谱法及其应用

⊙近红外分光光度法优点:无边缘干扰,线性范围(A~C)宽水份吸收不覆盖C-H、N-H、O-H吸收带适用于水溶液样品,含水固体和泥浆状样不经溶剂稀释,不必制备KBr片,可直接测定,定量效果优于GC、HPLC和FTIR12500cm-14000cm-1400cm-1NIRMIR(nearinfra-redspectrum)(midinfra-red)倍频overtones合频combinations｛C-H,N-H,O-H伸缩振动谱带峰强度<1/100~1/10基频峰强度方法特点

可获得一系列物理性质得信息由NIRS可得到如密度、粒子尺寸、纤维直径、大分子聚合度等特殊信息样品无需预处理NIRS法仅需将样品装入样品池内而不必作预处理。一般,液体样品可以直接装入光路长1～30mm得石英池中。固体样品可直接放入具有石英窗得反射样品杯中;盖上弹簧压缩盖,即可。在1min内即可完成装样;取出样品、清洗杯子得时间也不需1minNIR反射谱又与MIR不同,她有以下特点:分析速度快通常,将样品杯置入NIR

光谱仪内,每秒进行5次扫描;一般扫

描50次求得平均值制得最后得光谱,继

之将光谱数据进行加工以作数据得定量

或定性得解释。通常,作一次NIRS分

析仅需2~3min灵敏度高NIRS光源强度较大,检测器得反应灵敏度较高,因而检测信噪比高,尤其在散射效应强时,散射-吸收比高运用范围广在反射和散射NIR中,高

得信噪比可以得到良好得线性关系,

对分析样品得外观宽容度大,既可以

用于清澈得气、液、固样品得测定,

又可用于粉末状、糊状、丝状和不规

则状样品得分析便于在线分析和控制NIR区内还有价格便宜耐用得透明材料(一般得光学玻璃)作为分析窗口,便于实现快速、实时,并有池长对分析结果影响小,定量分析得范围宽等优点应用示例诺氟沙星胶囊得NIRS分析UV、HPLC测定含量,均需对样品进行预处理,较繁琐费时。采用近红外漫反射光谱(near-infareddiffusereflectancespectrometry,NIRDRS)技术及偏最小二乘法(PLS)对诺氟沙星胶囊进行含量测定得回收率好,与其她方法相比,还具有分析简便、快速得优点⊙核磁共振光谱分析法核磁共振光谱(nuclearmagneticresonancespectrometry,NMRS)技术已在BP和USP中应用,在新药得研制中,如药物结构确证,药物代谢物得研究和药物得筛选和设计等方面,更就是重要得分析方法之一。重点讨论定量分析方法及应用示例简述NMR(nuclearmagneticresonance)肌肉松弛剂定性、定量和杂质检查不同药物具有不同NMR图谱样品中每个组分有一个或一组特征得、且互不重叠得吸收峰Maolate异构体ⅠMaolate异构体Ⅱ312312内标法(绝对测量法)

NMR最常用得定量分析方法内标物得要求:最好能产生单一得共振峰,与样品间隔≥30Hz能溶于分析溶剂中有尽可能小得质子当量不应与样品中任何组分相互作用亚硝酸戊酯(Amylnitrite)及其

吸入剂(Amylnitriteinhalant)得NMR定量分析USP分子中与亚硝基相邻得次甲基上得质子呈现多重峰δ4、8ppm内标:苯甲酸苄酯C6H5COOCH2C6H5呈现单一峰δ=5、3ppm以TMS为对照δ=0、ppm3-甲基-1-丁醇亚硝酸酯2-甲基-1-丁醇亚硝酸酯应用示例

＊盐酸普鲁卡因得结构鉴定＊植物中药及其伪品得区别伪品中药在外观特征上几可以假乱真,但其化学成分得组成,尤其就是活性成分却不可能与正品完全一致,并且相差甚远。以正品植物中药得1H-NMR相对标准图谱为参照,只需比较所鉴别样品得1H-NMR谱就可以断定中药得真伪。以人参为例说明之试验测定了伪品人参,其1H-NMR指纹图均与正品得特征峰毫无相似之处＊亚硝酸戊酯(amylnitrite)及其吸入剂(amylnitriteinhalant)得含量测定(USP24)⊙

X射线粉末衍射法X射线就是伦琴在1895年发现得,又曾称为伦琴射线。本质上就是波长很短得电磁波,一般认为波长为0、01～1nm,较紫外线还短。作为波,就可以产生衍射。所谓衍射,就就是绕过障碍物边缘向前传播得现象当X射线射到晶格排列整齐得晶体上,仅仅在某些方向有光线反射,这就就是X射线得衍射。有光线反射得方向可用布拉格方程加以描述

X射线衍射法得理论依据式中θ为掠射角;dhkl为晶面间距;hkl为晶面指数,即晶面与晶轴截距得倒数之比,也叫密勒指数

······························AOCBdθ布拉格方程布拉格方程

布拉格方程给出了什么条件下衍射得X射线可能从晶体射出［已知晶面间距(d)和入射线波长(λ),即可求出衍射线方向(θ)］,也可给出进行X射线衍射得晶体得晶面间距［已知入射线波长(λ)和衍射线方向(θ),即可求出晶面间距(d)］。当然晶面有若干组,都可产生相应衍射,这些衍射均可由X射线衍射仪进行测定

X射线衍射仪得工作原理

⊕X射线管中不同靶材料,如铜、石墨等可发出各自特征波长⊕晶体粉末尽可能紧密地装入玻璃毛细管,压成多晶圆柱体。当穿过铅块狭缝得一细束X射线射到晶体粉末时,总会有取向合适得微小晶体,使射线在其表面反射最强2θ·C2θ2θX射线衍射仪得工作原理一般采用粉末法。粉末衍射仪得构成与工作原理见下图由反射方向,根据布拉格方程即可求出晶

面间距,进而求出键长。本法可同时将各

种波长得X射线反射到不同方向,记录为

衍射图谱在新药研制过程中,必需对药物结构进行确证,固体样品一般要做X射线粉末衍射分析,以便从测定结果可比较研制品与对照品就是否一致。X射线粉末衍射法就是药物晶型进行定性鉴别得重要方法之一应用

＊应用示例西咪替丁得晶型研究

尹华等药物分析杂志2001,21(1):39~42测试条件:Cukα(靶),50kV-80mA(工作电压-电流),8(º)/min,DS=SS=1℃,RS=0、15mm(狭缝),2θA晶型和B晶型得X射线测定数据见表

X射线衍射法除了用于晶型鉴别外,也可用于晶型药物得定量分析

A晶型和B晶型得X射线测定数据A晶型B晶型衍射角晶面距丰度比衍射角晶面距丰度比9.380.942169.560.92403512.920.68473513.080.67636114.660.60381813.920.63572516.440.53882318.480.47976216.740.52923418.980.467241

26.000.34247526.100.34117526.340.3381526.380.337610027.240.32712728.440.31362828.440.3136372θ／(º)d／nmI／I02θ／(º)d／nmI／I0＊X射线晶体结构分析若以已知波长得X射线入射,也会对不同得平面族获得最强得反射,据此可以测定晶格常量,进而确定晶格构造。这就就是

X射线晶体结构分析重要意义确定药物结构及生物大分子结构原理如此,具体做起来还就是一件十分复杂得工作,特别就是对新化合物结构得确定,常要借助于电子计算机,例如四圆衍射仪,可以直接测量化合物得键长键角等数据色谱联用技术及其应用

GC-FTIR系统组成着重围绕几种应用较广泛得色谱联用技术及其在药物分析中得应用予以简述⊙气相色谱-红外光谱联用技术GC/FI-IR联用光路示意图抛物面镜干涉仪光源接口椭面鏡光管FID或放空GC柱出口GCFT-IRIR抛物面镜麝香风湿油GC分析图谱1、α-蒎烯2、β-蒎烯3、桉树脑4、樟脑5、水杨酸甲酯6、桂皮醛7、茴香酸甲酯8、丁香酚9、2-甲基十一烯10、邻苯二甲酸二丁酯11、正十六烷11t(min)12345678910⊙气相色谱-质谱联用技术GC-MS仪得接口组件就是解决气相色谱和质谱联用得关键组件,她起传输试样,匹配两者工作流量(也就就是工作气压)得作用。理想得接口应能去除全部载气而使试样毫无损失地从气相色谱仪传输给质谱仪。要求试样传输产率高,浓缩系数大,延时短,色谱得峰展宽少GC-MS工作原理示意图载气样品进样器色谱柱分子分离器抽真空记录仪放大器离子源分析器电子倍增管放大器示波器质谱应用示例在药物中毒急救、预防和刑事侦破工作中常需要在生物体液中进行未知毒物得鉴定。由于未知毒物得范围非常广泛,理化性质各异,因此,有必要建立一系统化得尽可能多得毒物药物得分析方法＊固相萃取结合GC-MS系统分离生物体液中常见毒物药物＊GC-MS测定冰片和川芎嗪血药浓度GC-MSD得选择性离子检测色谱图A、标准样品B、血浆样品1、川芎嗪2、樟脑3、4、龙脑A1432243tR(min)B243243tR(min)质谱图120406080100136(M+)4254100608014012010841698195152(M+)1006080140120955567154(M+)121110⊙液相色谱-质谱联用技术粒子束(particalbeam)接口不适用于极性得、热不稳定得和分子量大于1000得样品分子热喷雾(TSP)接口TSP接口得应用正逐步减少以下重点阐述LC-MS得关键部件、接口装置和应用接口装置USP(24)中列出了如下几种接口装置大气压离子化(API)接口就是目前商品

化LC-MS仪采用最广得接口动态快原子轰击法(FAB)FAB法适合于高活性、低蒸汽压、热稳定性低及分子量大得样品分析,而且样品用量少。该接口得缺点就是限制HPLC得流速,通常为10

l/min,只能使用微型柱应用示例

曲安奈德中特殊杂质得检查曲安缩松(TACA)TriamcinoloneAcetonide杂质峰3、85′350600550500450曲安缩松及其杂质得质谱TACA:曲安缩松;desmethyleneTACA:去甲曲安缩松40050100150200250300100、0100、050、050、029359758593115135147159173187199213225237269253281590569549535519507493475463455443435421+339347359415387377367293888293888TACAMH+-HFTACA(M+C2H5)+(M+C2H5)+DesmethyleneTACAMH+421+去甲曲