《2.2 动物细胞培养》教学课件2

动物细胞培养

在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？

借助动物细胞培养技术构建人造皮肤。

不能用单个细胞培养出可供移植的皮肤。原理：细胞分裂增殖（有丝分裂）过程：动物细胞培养是指从动物体中_____出相关的_______，将它们_______________，然后在_________________下，让这些细胞______和______的技术。生长取组织分散成单个细胞适宜的培养条件增殖

目的：获得细胞或者细胞产物地位：动物细胞工程的基础动物细胞培养动物组织胰蛋白酶胶原蛋白酶单个细胞培养液细胞悬液原代培养传代培养细胞株（系）无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境其他条件营养条件动物细胞培养的条件糖类、氨基酸、无机盐、维生素、血清等动物体内的细胞之所以为何能够维持正常的生命活动，有些细胞还能不断增殖？机体给这些细胞提供了适宜的条件，包括充足的营养、稳定的内环境。

动物细胞培养的需要何条件？动物细胞培养的条件（1）营养条件：①培养基的构成：②合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基称为合成培养基。③血清等一些天然成分：由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。血清可补充合成培养基中缺乏的物质。④培养基类型：一般使用液体培养基（培养液）。合成培养基+血清等一些天然成分为什么要加入动物血清？

血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白质主要为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本原料，且有些必需氨基酸必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素等。血清还含多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，它们能促进细胞的生长、增殖和贴附。在培养动物细胞时，为保证细胞能够顺利生长和增殖，需在培养基中添加10%~20％血清等天然成分。（2）无菌、无毒的环境：清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理②在无菌环境下进行操作③可根据实际情况适量添加抗生素培养液需要定期更换：（3）温度、pH和渗透压：①适宜的温度：哺乳动物细胞培养的温度多以___________为宜；②适宜的pH：多数动物细胞的适宜pH为_______。③适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能36.5±0.5℃7.2-7.4（4）气体环境：O2是细胞代谢所必需CO2则维持培养液的pH通常采用培养皿或松盖培养瓶置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养①气体的组成及作用：②容器③仪器动物细胞培养的两大类型细胞能够悬浮在培养液中生长增殖；需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这类型。二、动物细胞培养的过程细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。（一）动物组织的取材动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。动物细胞培养为何要选取幼龄的动物组织器官？细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。动物细胞培养的过程（二）制成细胞悬液1.将组织分散成单个细胞①方法:用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理②原因:a.细胞间靠在一起的细胞彼此限制生长和增殖；b.使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换2.用培养液将细胞制成细胞悬液。将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养。（三）原代培养动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。操作方法：将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。（四）传代培养思考1.需分瓶进行传代培养的原因？

悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象。操作方法①收集细胞a.悬浮生长类直接用离心法收集b.贴壁生长类重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养

胰蛋白酶第一次使用的目的是使组织细胞分散开，第二次使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分装后继续培养。思考2.为什么要使用胰蛋白酶？有何作用？

胰蛋白酶的作用：消化细胞间的蛋白质，使组织分散成单个细胞。胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白等，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。思考3.两次胰蛋白酶的目的相同吗？动物胚胎或幼龄动物的组织、器官单个细胞细胞悬浮液原代细胞大量细胞胰蛋白酶因这些细胞生命力旺盛，分裂能力强。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和增殖。因细胞贴壁生长到表面相互接触时就停止分裂增殖，故需定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来传代培养。加培养液原代培养传代培养胰蛋白酶植物组织培养与动物细胞培养的区别项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基状态特有取材接种前处理培养过程生长特点培养结果植物激素及有机添加物动物血清和血浆离体的植物器官、组织或细胞离体的胚胎；幼龄动物的组织、器官脱分化、再分化原代培养传代培养植物体大量细胞植物细胞的全能性细胞的增殖胰蛋白酶或胶原蛋白酶使组织散成单细胞消毒固态液态贴壁生长、接触抑制细胞增殖不分化愈伤组织、胚状体细胞增殖分化干细胞定义：动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。分布：干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。胚胎干细胞（ES细胞）成体干细胞诱导多能干细胞（iPS细胞）分类：干细胞培养及其应用①胚胎干细胞（简称ES

细胞）分布：存在于早期胚胎中特点：具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。实例：ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等。局限性：胚胎干细胞必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。举例：骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、睾丸中的精原干细胞等；②成体干细胞分布：存在于成体组织或器官内中发现最早、研究最多、应用最成熟的实例是造血干细胞；主存于成体的骨髓、外周血和脐带血中。特点：具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。

有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。诱导多能干细胞（iPS细胞）概念：通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。诱导方法：将特定基因或特定蛋白导入细胞或用小分子化合物诱导形成。优点①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。取成纤维细胞转入相关因子细胞转化为iPS细胞诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞移植回病人体内诱导多能干细胞应用类型应用造血干细胞神经干细胞诱导多能干细胞（iPS细胞）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展干细胞应用面临问题存在导致肿瘤发生的风险。1.动物细胞培养的条件是（

）①无菌无毒的环境

②营养

③气体环境④温度、pH和渗透压⑤透明的容器A.①②③④B.①②③⑤C.②③④⑤D.①③④⑤B课堂练习2.相对细菌和植物细胞而言，动物细胞离体培养更需关注培养基的渗透压，是因为动物细胞（）A.没有中央液泡，不能发生渗透作用B.渗透压远高于细菌或植物细胞的渗透压C.没有细胞壁，易吸水涨破D.生长缓慢，各生长阶段对环境的渗透压要求不同C课堂练习3.下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）A.培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清B.原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长停滞C.动物细胞培养一般能够传到40～50代，但其遗传物质发生了改变D.动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞C（3）培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有___________等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第_____代。（4）为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用___________处理，然后配置成__________，再分装。4.下图是动物细胞培养的基本过程示意图