不同灸法对大鼠溃疡性结肠炎调节机制的研究

1/1不同灸法对大鼠溃疡性结肠炎调节机制的研究（不同灸法对大鼠溃疡性结肠炎调节机制的研究#崔云华1，吴焕淦1，刘慧荣1，周爽1,2，万华3，王晓梅1，华雪桂1，崔学军1**（1.上海中医药大学针灸经络研究所，上海200030；2.第二军医大学中医系，上海200433；3.上海中医药大学附属曙光医院，上海200021）摘要：

目的:探讨不同灸法对UC大鼠的影响,以及对COX-2、Bcl-2、Bax表达及PGE2的含量的影响。

方法:采用免疫学方法，并加局部刺激制备实验性UC大鼠模型。

造模后采用不同灸法治疗14次，处死动物取材，用免疫组化法检测COX-2、Bcl-2、Bax，用放射免疫法测定PGE2含量。

结果:（1）UC模型大鼠结肠组织COX-2、Bcl-2的表达和PGE的含量显著高于正常大鼠(Ｐ0.01),而Bax的表达显著低于正常大鼠(Ｐ0.01)；（2）经过不同灸法治疗后,与模型对照组比较各治疗组COX-2、Bcl-2的表达和PGE2的含量均显著降低(Ｐ0.01)。

（3）在下调PGE2含量、Bcl-2的表达和下调COX-2表达阳性面积、强度以及免疫组化指数方面，隔姜灸组、隔蒜灸组调节作用优于温和灸组。

(Ｐ0.01，Ｐ0.05，Ｐ0.01)结论:不同艾灸干预可抑制UC机体结肠组织COX-2、Bcl-2的表达和降低PGE2的含量，调节Bcl-2/Bax的比例关系；艾柱间接灸法（隔姜灸、隔蒜灸）治疗溃疡性结肠炎优于温和灸。

关键词：

针灸推拿学；溃疡性结肠炎；灸法；COX-2；Bcl-2/Bax；实验研究中图分类号：

R245.815101520ResearchonRegulatoryMechanismofDifferentMoxibustionTherapyforUCRatCUIYunhua1,WUHuangan1,LIUHuirong1,ZHOUShuang1,2,WANHua3,WANGXiaomei1,HUAXuegui1,CUIXuejun1(1.ShanghaiInstituteofAcupuncture-moxibustionandMeridians,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShangHai200030;2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,SecondMilitaryMedicalUniversity,ShangHai200433;3.ShuguangHospitalaffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShangHai200021)Abstract:ObjectiveInordertocompareeffectofdifferentmoxibustiontherapyonUC,observetheeffectofdifferentmoxibustiontherapyonexpressionofCOX-2、Bcl-2、BaxandcontentofPGE2.MethodsUCRatmodelwassetupbyimmunologicalmethodandregionalexcitation.Afterthemodelwassetup,14treatmentsweregivenwithdifferentmoxibustiontherapyonUC.COX-2、Bcl-2、BaxweredetectedbyimmunologicalhistochemistryandPGE2wasdetectedbyradio-immunityafterexecutingtherats.Results(1)ExpressionofCOX-2、Bcl-2、BaxandcontentofPGE2ofcoloninUCmodelratsaresignificantlyhigherthanthatinnormalrats.(Ｐ0.01)ExpressionofBaxofcoloninUCmodelratsislowerthanthatinnormalrats.(Ｐ0.01)(2)Afterdifferentmoxibustiontherapy,expressionofCOX-2、Bcl-2andcontentofPGE2ofcoloninUCratsweresignificantlylowerbycomparingwithcontrolgroup.(Ｐ0.01)(3)ginger-partitionmoxibustiongroupandgarlic-partitionmoxibustionisbettereffectthanwarmingmoxibustiongroupondownregulationofexpressionofPGE2、Bcl-2andpositiveareaofCOX-2.(Ｐ0.01，Ｐ0.05，Ｐ0.01)ConclusionsExpressionofCOX-2、Bcl-2、BaxandcontentofPGE2ofcoloncanbeinhibitedandcontentofPGE2canbedownregulatedandratioofBcl-2andBaxcanberegulatedbydifferentmoxibustiontherapy.Moxaconeindirectmoxibustion基金项目：

高等学校博士学科点专项科研基金（200802680001）作者简介：

崔云华，（1973-），女，副研究员，主要研究方向：

针灸效应机制研究。

通信联系人：

周爽，1972-），女，副教授，主要研究方向，针灸作用机理研究。

E-mail:szhouwork@-1-2530354045采用隔药灸治疗溃疡性结肠炎取得了较好的效果。

隔药灸仅是艾therapy(ginger-partitionmoxibustionandgarlic-partition)isbettereffectthanwarmingmoxibustionontreatingUC.Keywords:AcupunctureandMoxibustionandTuinaofChinesemedicine;UC;moxibustiontherapy;COX-2;Bcl-2/Bax;experimentalstudy500引言笔者以往的研究[1-3等],柱间接灸法的一种，针灸临床上常用的艾柱间接灸法还有隔姜灸、隔蒜灸等。

本实验拟探讨隔姜灸、隔蒜灸及温和灸等不同灸法对大鼠溃疡性结肠炎的作用差异,为隔姜灸、隔蒜灸及55温和灸治疗溃疡性结肠炎提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1材料与方法实验动物与分组1.1雄性SD大鼠，SPF级，体重140g20g，50只，由上海中医药大学实验动物中心提供。

所有动物购回后饲养于上海中医药大学实验动物中心动物室，室温2310℃，适应性喂养60一周，无不良反应，饮食、饮水正常者，即纳入实验。

实验大鼠随机分为正常组、模型组、隔姜灸组、隔蒜灸组、温和灸组，每组各10只。

实验主要试剂1.2兔抗大鼠COX-2单克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗大鼠Bax单克隆抗体、羊抗兔SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（以上均为Boster,Wuhan公司提供），PGE2RIAKit65（苏州医学院提供），DEPC（Sigma,USA提供），TRIzol试剂（GibcoBRL,USA提供），三氯甲烷（上海化学试剂厂提供）。

实验主要仪器1.3石蜡切片机（AO820rotarymicrotome）、OlympusBH2生物显微镜（Japan）、Panasonic摄象机（Japan）、IMS细胞图象分析系统（上海申腾信息技术有限公司）、PT1200细胞超70声破碎仪（Switzerland）、AEL-200精密电子天平（Shimadaz,Japan）低温高速离心机（Heraeus,Germany）、SH-682放射免疫计数器（原子核所）、可调移液器(1000l,200l,40l,10l)（Finnpiprettes(Labsystems)）、1.5ml离心管及0.5ml薄壁PCR管(USA)、J-30I高速冷冻离心机（Beckman,USA）、320pHMeter（Beckman,USA）。

1.4造模方法75采用人体术后的新鲜结肠粘膜，加适量生理盐水制成粘膜匀浆，冷冻24h，溶冻后以3000r/min离心30min，取上清液提纯测定蛋白质含量，并与Freund佐剂混合配成乳剂。

除正常组外其他各组大鼠首次每只足趾内注射抗原3mg，并在10d，17d，24d，31d分别于足趾、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6mg（末次注射不加Freund佐剂），至血清抗结肠抗体达到一定效价，对造模大鼠用2%戊巴比妥钠30mg/kg行腹腔内注射麻醉，用3%福尔马80林2ml灌肠，留置1h，以生理盐水洗净后排出，再用抗原液（10mg/ml不加佐剂）2ml灌肠，留置2h，洗净排去。

正常组大鼠用生理盐水作与造模各组相同处理。

-2-1.5处理方法用材：

特制细艾条。

新鲜蒜、姜切取直径0.5cm，厚0.3cm片，中穿数孔备用。

选穴[4]：

取天枢穴（双）、气海穴。

天枢定位相当于脐中旁开0.5cm左右,气海定位脐下1.0cm处。

85治疗方法：

正常组：

不做任何治疗。

模型组：

只作与各治疗组相同的抓取固定，而不做任何治疗。

温和灸组：

每穴悬灸。

隔姜灸组：

每穴隔姜灸2壮。

隔蒜灸组：

每穴隔蒜灸2壮。

疗程：

每次每穴10min，每日1次，共灸14次。

样本制备1.6于治疗结束后次日断头处死各组大鼠，剖开腹腔，切取远端结肠，用预冷的4℃生理盐90水漂洗，滤纸吸干，称取200mg左右，置于冰浴中盛有生理盐水的匀浆器中，进行组织粉碎匀浆后，37℃保温15min，3500rpm离心15min，将上清液移入Ep管，-20℃保存备测PGE2。

另取3-4cm置10%福尔马林中固定备COX-2、Bcl-2、Bax免疫组化检测。

1.71.7.1COX-2、Bcl-2、Bax表达的测定95观察指标与测定方法按免疫组化染色SABC法（StreptomycesAvidinBiotin-PeroxidaseComplextechnique）常规步骤操作，具体如下：

(1)标本石蜡包埋、切片5m厚。

常规脱蜡至水。

玻片预先经多聚赖氨酸处理。

(2)将标本片置入3％H202中，室温10min，以灭活内源性过氧化物酶。

双蒸水洗，2min3次。

100105110(3)滴加复合消化液，室温10min。

双蒸水洗，2min3次。

(4)滴加抗原修复液，室温10min。

双蒸水洗，2min3次。

(5)滴加正常山羊血清，室温10min。

吸干液体，不洗。

(6)滴加一抗（兔抗大鼠，工作浓度1：

150）。

置4℃，48h。

0.01MPBS洗，3min3次。

(7)滴加生物素化山羊抗兔IgG，置37℃30min。

0.01MPBS洗，3min3次。

(8)滴加SABC，置37℃30min。

0.01MPBS洗，3min3次。

(9)DAB显色。

(10)苏木素轻度复染。

(11)脱水、透明、封片。

同时设阴性替代片做对照：

用正常山羊血清代替一抗。

阳性染色呈棕黄色，阴性对照片无阳性染色。

每张切片随机采集3个不同视野，运用IMS细胞图象分析系统检测阳性表达面积与强度，取平均值进行分析。

并通过阳性表达面积强度计算IHC阳性指数PGE2含量测定1.8统计学处理1.7.2115PGE2含量测定用放射免疫法，具体操作依据试剂盒说明书进行。

数据用均数标准差（xs）表示，运用SPSS11.0统计软件进行统计学分析，各组数据比较采用F、q检验。

-3-108.1619.39**109.1414.82**114.0920.12*12496.9322956.800*10702.543985.164*15007.5242499.152*21262.6192205.682*16.850.77*△14.470.69*217110.8037982.07*357886.0136639.53*152350.7739689.38*△132373.8715654.10*△2结果2.1120不同灸法对溃疡性结肠炎大鼠结肠PGE2含量的影响表2-1各组大鼠结肠PGE2含量的比较（pg/ml,xs）NPGE2-14组别1092.2010.18正常组9130.9818.37*模型组隔姜灸组隔蒜灸组温和灸组101010△△△△注：

与正常组比较，*p0.01,**p0.05；与模型组比较，▲▲p0.05；与隔蒜灸组比较，p0.01,△△p0.05；与隔姜灸组比较，▲p0.01,p0.01,

p0.05（以下各表同此）125从表2-1可见，模型组大鼠结肠PGE2含量与正常组比较显著上调（P0.01），隔姜灸组、隔蒜灸组、温和灸组大鼠经治疗后，PGE2含量显著下调，与模型组比较均有显著差异（P0.05，P0.01）。

不同灸法对溃疡性结肠炎大鼠结肠COX-2表达的影响2.2130表2-2各组大鼠结肠COX-2表达的比较（xs）组别正常组模型组隔姜灸组隔蒜灸组温和灸组N109101010阳性面积（m2）强度6068.3751183.2996.830.95IHC指数41808.6312243.36△12.201.24*△12.370.94*△▲

▲

▲

图1正常组（IHC200）图2模型组（IHC200）-4-12702.4612100.410*12320.8032136.528*14541.6972548.895*图3图5温和灸组（IHC200）隔蒜灸组（IHC200）图4隔姜灸组（IHC200）从表2-2、图15可见，模型组大鼠结肠COX-2表达在阳性面积、强度，以及免疫组化指数与正常组比较均与显著差异（p0.01），隔姜灸组、隔蒜灸组、温和灸组大鼠经治疗后，COX-2表达阳性面积、强度，以及免疫组化指数显著下调，与模型组比较均与显著差异135（p0.01）,其中隔姜灸组、隔蒜灸组调节作用优于温和灸组（p0.01）。

不同灸法对溃疡性结肠炎大鼠结肠Bcl-2表达的影响2.3表2-3各组大鼠结肠Bcl-2表达的比较（xs）组别正常组模型组隔姜灸组隔蒜灸组温和灸组N109101010阳性面积（m2）强度9883.785610.8619.400.6625911.9472070.497*17.301.71*△IHC指数92993.679981.80448461.3760069.37*152710.5529241.90*△140803.7324462.38*△194515.7639021.02*▲

△▲▲

12.000.86*△11.430.39*△13.330.98*▲

-5-图6正常组（IHC200）图7图9隔姜灸组（IHC200）模型组（IHC200）图8温和灸组（IHC200）图10隔蒜灸组（IHC200）从表2-3、图610可见，模型组大鼠结肠中Bcl-2的表达在阳性面积、强度、IHC指数方面均显著上调，与正常组比较具有显著差异（p0.01）；隔姜灸组、隔蒜灸组、温和灸组140大鼠结肠中Bcl-2的表达明显下调，与模型组比较具有显著差异（p0.01），其中隔姜灸组、隔蒜灸组效果尤佳，与温和灸组比较差异具有显著性（p0.05，p0.01）。

-6-2.4不同灸法对溃疡性结肠炎大鼠结肠Bax表达的影响表2-4各组大鼠结肠Bax表达的比较（xs）组别正常组模型组隔姜灸组隔蒜灸组温和灸组N109101010阳性面积（m2）26972.6153326.58818.271.3515415.2791376.144*13.001.01*16641.8191956.204*13.370.97*16659.8792301.175*13.331.08*15987.1692597.220*12.931.25*强度IHC指数493437.2679193.54200150.7722244.43*223032.8935356.53*221513.0131081.03*206171.5036973.80*图11正常组（IHC200）图13温和灸组（IHC200）隔蒜灸组（IHC200）图12模型组（IHC200）图14隔姜灸组（IHC200）图15145从表2-4、图1115可见，模型组大鼠结肠中Bax的表达在阳性面积、强度、IHC指数-7-广应用等打下良好基础。

笔者以往的研究[1-3]采用隔药灸治疗溃疡性结肠炎取得了较好的效果。

而隔药灸是艾柱间接灸法的一种，针灸临床上常用的艾柱间接灸法还有隔姜灸、隔蒜灸疡性结肠炎的作用优于温和灸。

这说明除了隔药灸[1-3,]外，隔姜灸、隔蒜灸这些艾柱间接法治疗溃疡性结肠炎同样可以取得较好疗效。

此进一步表明：

在治疗溃疡性结肠炎上，艾柱间接灸法优于温和灸。

间接灸不仅能发挥艾灸的作用，而且还能发挥所用药物的药理作用。

间方面均显著下调，与正常组比较具有显著差异（p0.01）；隔姜灸组、隔蒜灸组、温和灸组对Bax表达的影响在IHC指数方面与模型组均无显著差异。

3讨论150155160165170175180灸法，是针灸学中重要的治疗手段之一，由于各种主客观原因的制约，自近代以来，历史上曾鼎盛发展且疗效确切的灸疗技术遇到了新的阻力和困难，国内重针轻灸、或只针不灸、国外有针无灸的现状，迫切需要开展灸法临床与基础研究，为提高灸法临床疗效，推等等。

因此从不同灸法的角度进一步探讨隔姜灸、隔蒜灸及温和灸对大鼠溃疡性结肠炎的作用具有重要意义。

COX-2在正常结肠粘膜表达很少，而炎症粘膜上皮细胞及结肠固有层单核炎性细胞大量表达[5]，说明COX-2的表达与UC的发病及病情变化有关。

COX-2可通过减少AA,增加PGE－2水平来调节各种促凋亡和抑凋亡因子的表达[6]。

Bcl-2是一种抗细胞调亡的基因，Bax与Bcl-2作用相反，起促进细胞调亡的作用。

结肠黏膜细胞和炎性细胞的凋亡程序的紊乱与UC的发病和病情有直接的关系。

本实验结果UC模型大鼠结肠组织COX-2、Bcl-2的表达和PGE的含量显著高于正常大鼠(Ｐ均0.01),而Bax的表达显著低于正常大鼠(Ｐ均0.01)。

表明实验性UC大鼠COX-2、Bcl-2的表达和PGE的含量上调,结合组织病理学观察UC模型大鼠结肠黏膜可见充血、水肿、糜烂、溃疡,提示COX-2、Bcl-2的表达和PGE的含量与实验性UC的发生密切相关。

经过天枢穴（双）、气海穴进行灸疗后,与模型对照组比较各治疗组COX-2、Bcl-2的表达和PGE-2的含量均显著降低(Ｐ均0.01),结肠黏膜溃疡面损伤修复,表明艾灸取效与其抑制结肠组织COX-2、Bcl-2的表达和PGE的含量有关。

虽然治疗后Bax的表达与模型组无明显差异，但通过治疗使Bcl-2的表达下调，从而改变了Bcl-2/Bax的比例关系，使细胞调亡趋于正常而达到治疗UC的目的。

通过不同灸法对UC模型大鼠的治疗说明了灸疗的有效性，并说明不同灸疗的作用能够使患病机体的发病基因发生变化。

所以，灸疗不仅仅是改善疾病的临床症状，而且能引起机体某些基因发生改变，从而达到治疗疾病的目的。

本研究在下调PG