β-胡萝卜素生物合成及高产菌株选育研究进展

β-胡萝卜素生物合成及高产菌株选育研究进展β-胡萝卜素生物合成及高产菌株选育研究进展/β-胡萝卜素生物合成及高产菌株选育研究进展JIANGXIAGRICULTURALUNIVERSITY课程论文（设计）题目：β－胡萝卜素生物合成及高产菌株选育研究进展学院：生物科学及工程学院姓名：学号：专业：指导教师：二0一七年七月β－胡萝卜素生物合成及高产菌株选育研究进展早在19世纪30年代，化学家Wachenrooder就从胡萝卜根中分离得出一种物质，并以“胡萝卜素”命名。此后随着生化科技的发展，又分离出一系列的天然色素，命名为“类胡萝卜素”。类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，普遍存在于藻类、真菌、动物和高等植物中的红色、橙红色或黄色的色素之中ADDINNE.Ref.{2C52E89F-9E2D-4516-8527-8ACDC8C737C5}[1]，性质非常的不稳定，其结构见光、受热、遇氧均易受到破坏。到目前为止，被发现的天然类胡萝卜素已经高达600多种ADDINNE.Ref.{D7A4D44C-89C4-41AA-AD38-43A8C74509DB}[2,3]，类胡萝卜素主要存在以下几类：a-胡萝卜素(a--Carotene)、β-胡萝卜素(β-Carotene)、Y-胡萝卜素(y-Carotene)和番茄红素(Lycopene)ADDINNE.Ref.{2107B6FD-8232-4ABA-BD29-12B068372AB1}[4]。通过多数研究表明，β-胡萝卜素物质主要存在于天然的果蔬当中ADDINNE.Ref.{B511E767-3CB2-4481-A720-83E27A644E8E}[5,6]，且具有较强抗氧化性ADDINNE.Ref.{C7A97160-4EB3-4357-922B-DE419F8A0D9B}[7]，能够预防和并且治愈糖尿病ADDINNE.Ref.{7790ED0F-A8BC-43AF-B871-A4518114B91C}[8]，降低心血管疾病发病率ADDINNE.Ref.{98EE1F8D-C67C-46D4-B729-F365DBEDC968}[9]，具有抗癌和保护视力ADDINNE.Ref.{819E4078-CBF1-47FC-9E78-00ACEB27B0F4}[10]等多种生理功能。在天然环境条件下β-胡萝卜素是所有动物体内维生素A的主要来源，大概有10%的类胡萝卜素（最主要是α-胡萝卜素、β-胡萝卜素）被作为维生素A的前体利用，其中以β-胡萝卜素为前体的维生素A的原活性最高ADDINNE.Ref.{4046B40E-DC67-46BD-939A-4A5B38E045B5}[11,12]，这主要是由于β-胡萝卜素具有的对称结构，1分子β-胡萝卜素可以生成2分子的维生素AADDINNE.Ref.{99D652E9-0AE3-4D32-9031-D86BF3D5C6F5}[11]。β-胡萝卜素（C40H56）作为类胡萝卜素的一种，也是橘黄色的脂溶性化合物，它是自然界中最广泛存在也是最为稳定的天然色素。随着人们对健康意识的加强，对天然β-胡萝卜素的需求量极大增加，开发以及利用β-胡萝卜素已经成为一个全球瞩目的发展态势ADDINNE.Ref.{A3C26F37-D4F5-4112-8233-799927B32F3E}[13]。1国内外生产现状对比β-胡萝卜素作为一种天然的色素，类属于四萜类化合物。有极其高的营养学和药物学价值，现如今已被化妆品、医药、食品添加剂保健品等行业广泛应用ADDINNE.Ref.{0C206F65-DC03-493B-8204-9137C3749B16}[14]。正是基于这些价值，让β-胡萝卜素成为了国际社会上公认的一种优质天然色素，同时也是维生素A的前体。因此，β-胡萝卜素也已然成为了具有维生素A的原活性和良好着色双重功能的化学物质。随着人类的保健意识的增强和生活水平的提高，各式各样营养的食品添加剂的应用生产也逐步受到重视，而β-胡萝卜素就是其中的一种ADDINNE.Ref.{ADDAC554-4F5D-4048-9146-BDFFC2E7BDAD}[15]。β-胡萝卜素作为一种脂溶性色素，其自身的颜色由于脂类浓度的差异而会有所不同，颜色可包含由红色到黄色的所有色系，受到食品行业强烈的欢迎。β-胡萝卜素非常适合蛋白质性产品及油性产品的研发，比如说：素食产品、人造鱼浆炼制品、奶油、速食面的调色、胶囊等ADDINNE.Ref.{75C6CFD9-D3F4-447F-AB40-306633114BDF}[16]。通过微胶囊处理的β-胡萝卜素，能够转化成为水溶性的色素，可以应用几乎所有的食品。β-胡萝卜素在化妆品行业同样也有重大的用途，国内外近些年来已将天然β-胡萝卜素作为直接成分用于胭脂和口红等化妆品中。作为一种饲料添加剂，适量浓度的β-胡萝卜素能明显提高鸡鸭等家禽的产蛋率和蛋的孵化率，明显提高猪、牛初生的窝仔数，明显加深加深禽蛋的颜色，增强虾和蛙鱼的色质。随着人类对β-胡萝卜素生理功能的进一步探索研究和深入，发现其在临床上的医疗应用也越来越广泛。目前在临床上的医疗应用普遍有：防治冠心病、老年疾病，及预防心脑血管硬化、肿瘤，治疗白内障和夜盲症、治疗干眼病和呼吸道炎症、治疗胃溃疡和萎缩性胃炎、治疗复发性口腔溃疡、治疗瘢痕疙瘩、治疗矽肺病，对抗放射治疗的某些副作用。在增强肿瘤放疗疗效方面有：治疗红细胞生成性原卟啉症光敏性疾病ADDINNE.Ref.{9CF4BF37-3DB9-4412-B86B-CEEB3D440562}[17]。我国β-胡萝卜素的生产主要还是从富含β-胡萝卜素的植物当中提取，由盐藻培养，生物发酵法以及合成法4种方法。其中植物提取法主要还是因为原料生产成本过高，当中所含有的有效成分含量太低，从而影响其产业化。在80年代中期，上海第六制药厂用维生素A作为原料，用化学法配制的β-胡萝卜素已经研究成功，并且大量投人生产，其生产容量大约为1t/a。在80年代末期，中国轻工业部制盐研究所已经从塘沽盐场的盐藻中成功地提取出了β-胡萝卜素，并且在内蒙古的吉兰泰盐湖区建成了约12万m2扩盐藻养殖地和5Okg/aβ-胡萝卜素提取加工车间。2000年，武汉星辰现代生物工程有限公司开始自行生产天然β-胡萝卜素。由武汉星辰生物工程有限公司、江苏省微生物所和武汉病毒所共同完成的“2t/a发酵法生产天然β-胡萝卜素”课题项目于2001年已经完成鉴定，其技术在国际社会上处于领先的地位。目前，上海化工研究院、上海工业微生物所、上海化工研究院、江苏微生物研究所和中科院武汉病毒所的发酵法生产β-胡萝卜素技术已经十分成熟，可以实现工业化的生产。至今为止，全球的β-胡萝卜素的年需求量是1200-1500t/a，其中的95%是对天然产品的需求，年产量约600t，年销售额为2亿-2.5亿美元左右，且每年以7%-9%的速率递增。2000年我国的β-胡萝卜素产量为10t。2001年的生产容量已经达到了22t，生产的公司有4家,其中以发酵法生产的企业占了73%。我国β-胡萝卜素执行的质量标准是FAO/WHo（1984）。随着分析技术和毒理学的不断发展，通过大量研究表明，尽管用化学的方法合成β-胡萝卜素的生产成本低，纯度相对较高，但它的缺点就是某些胡萝卜素合成技术路线过于复杂，而且在某些合成的产品中，少量的化学成分有剧毒，能够导致染色体发生畸变，让人致癌。而天然的β-胡萝卜素则有很好的抗染色体畸变的作用，能够有效地预防癌变。所以，天然的β-胡萝卜素必将在未来的β-胡萝卜素市场中的占主导的地位[18]ADDINNE.Ref.{025AAEF5-FE96-4641-903A-C737C43A5C50}。2β-胡萝卜素研究进展2.1β-胡萝卜素的结构β-胡萝卜素(β-carotene)，别名叫做叶红素，它是一种天然的类胡萝卜素，广泛存在于黄色和红色的花朵、根茎、海藻、水果和蔬菜当中，类属于四萜类碳氢化合物，是类胡萝卜素家族成员中极其重要的一位。它的分子式为C40H55，摩尔质量为536.88，其结构是由中心骨架即单双键相间的长多烯碳原子，通过两端环化衍生出来的，其分子中含有4个异戊二烯侧链和2个β-紫罗酮环，整个的分子构象是对称的，也就是说两个β-紫罗酮环在两端，其中心断裂可以产生两个维生素A分子，有多个双键而且双键之间共轭。理论上一分子的β-胡萝卜素可以转化生成两分子的维生素A，故β-胡萝卜素又被称之为维生素A原。β-胡萝卜素是一种橘黄色的脂溶性化合物，隶属于类胡萝素，能够溶于苯、植物油、氯仿、石油醚和丙酮，不溶于丙三醇、甘油和水，难溶于乙醇和甲醇。β-胡萝卜素是一种由11个共轭双键组成的多烯体，结构中含有两个视黄基团ADDINNE.Ref.{796F4185-2D9E-4794-B8FC-DBA89F68BF39}[19,20]。β-紫罗酮可能以异构型、取代型、开环型的形式存在。天然β-胡萝卜素主要存在全反式、9-顺式、13-顺式及15-顺式四种形式ADDINNE.Ref.{280ACE0D-62DC-4190-9005-541373E45E36}[21]。其结构式如下图：图一β-胡萝卜素结构2.2β-胡萝卜素的理化性质β-胡萝卜素是一种颜色为深红色至暗红色，有光泽的斜方六面体或者结晶性粉末，无臭无味，稀溶液呈现橙黄色到黄色，浓度增大时则表现为橙色，因溶剂极性不同可能稍带红色，浓度极低时呈现为黄色，熔点为176℃-184℃。化学性质不稳定，遇到光线、热和氧气不稳定，容易在光照和加热时产生氧化反应，在弱碱的情况下比较稳定。因为它的分子结构中不存在不对称的手性碳原子，所以不具备旋光性。β-胡萝卜素容易溶于许多的有机溶剂，比如说：己烷、石油醚、甲苯、氯仿、四氯化碳、苯和二氯化碳，微溶于植物油，几乎不溶于甘油、丙二醇、乙醇、甲醇和水。2.2β-胡萝卜素的生理功能因为β-胡萝卜素特定的化学结构，所以它具有一些及健康有关的性质。β-胡萝卜素是维生素A的前体物质，而维生素A是一种极为重要的营养物质，不但在视力和预防夜盲症的方面起到了至关重要的作用，而且对于机体的正常免疫功能、生长、发展和胃肠道功能都有非常重要的影响。人体本身不能合成维生素A，因而，必须通过饮食等得到适当的补充。β-胡萝卜素是当前补充维生素A的最为安全的产品，其大体上主要还是存在于橙色、黄色和深绿色的水果(菠菜、两红柿、胡萝卜、芒果)和蔬菜当中ADDINNE.Ref.{D350B05D-6FBF-482F-BF15-E0C3D959F14D}[22-25]。且越是颜色鲜艳的水果或蔬菜，β-胡萝卜素的含量就越高。β-胡萝卜素具有很好的抗氧化功能，是-种常用的抗氧化剂ADDINNE.Ref.{52FD905B-D73E-4FDD-B0BA-019A4A43925F}[26,27]。β-胡萝卜素具有很好解毒疗效和良好的单线态氧的淸除性能，是维护人体健康必不可少的营养元素，可以防止体内自由基的攻击，预防心血管疾病、白内障和癌症以及因细胞老化和衰亡而引起的各种相关疾病，并且β-胡萝卜素作为维生素A原可以有效防止因为维生素A的缺乏所引起夜盲症，并且可以促进人体上皮细胞的正常成熟，同时也是理想的营养增补剂和食品着色剂。2.3β-胡萝卜素的合成β-胡萝卜素的合成方法主要有4个种：化学合成、植物提取、基因工程以及微物发酵法生产β-胡萝卜素。2.3.1植物法提取β-胡萝卜素至今为止，常见的萃取方法ADDINNE.Ref.{0B3CE555-DB77-48E6-9973-DB08348FD9A7}[28]主要包括：盐藻提取法、超临界流体C〇2萃取法以及有机溶剂萃取法。可是，天然的植物当中含有的代谢物水平通常比较低，及此同时萃取的工艺也相对复杂，导致β-胡萝卜素的产率通常很低。而且，由于植物的生长周期比较长，受到地理生长环境等诸多条件的限制。综合比较考虑，利用植物法提取β-胡萝卜素生产成本比较高，不适合企业的大规模工业生产ADDINNE.Ref.{C4F881E0-5F8C-4197-8448-0DEFFA05E1E0}[29]。2.3.2化学法合成β-胡萝卜素现如今90%的β-胡萝卜素都是通过化学合成的手段生产。用化学法生产β-胡萝卜素，生产成本很低，合成的工艺也较为纯熟，是目前为止合成β-胡萝卜素最主要的方法。但是，由于化合物结构的手性及复杂的程度，利化学方法合成β-胡萝卜素存在一定的局限性，因此阻碍了这种生产方法的继续发展，且在生产的过程当中，也有可能在产品当中残留一些有害的化学成分，对人体造成一定程度的损伤ADDINNE.Ref.{7AB65C56-DAA2-4CEB-8CF5-6130FFE7FA9C}[30]。2.3.3微生物发酵法生产β-胡萝卜素微生物发酵法是指利用天然的、具备β-胡萝卜素合成能力的微生物，如杜氏盐藻、布拉克须霉和三孢布拉氏霉等ADDINNE.Ref.{D578C680-6179-49BB-85D0-2026DD832ECF}[31]，通过对微生物进行定向培养，使其合成目标产物β-胡萝卜素，然后通过分离、细胞破碎、萃取等手段得到β-胡萝卜素。利用微生物发酵生产的β-胡萝卜素具有无毒、纯天然等特点ADDINNE.Ref.{896EBF05-7726-423A-A59D-C188A97C40F1}[32]，而且相比较于化学合成法生产的β-胡萝卜素而言，其更具有更良好的生物活性，因此，更加地受到广大消费者的青睐。但是，自然界中天然具备生产合成β-胡萝卜素的微生物种类少之又少，而且大多为具有致密的菌丝状结构的丝状真菌，不容易进行培养，这为微生物发酵产β-胡萝卜素大大的增加了难度。2.3.4基因工程法生产β-胡萝卜素利用基因工程法生产β-胡萝卜素是指利用分子生物学的手段将合成的β-胡萝卜素基因导入到选定的宿主细胞中构建基因工程菌，使得其能够合成β-胡萝卜素。利用基因工程的手段能够选择遗传背景较为清晰、易于基因操作、便于培养的宿主细胞进行规模化生产。酿酒酵母和大肠杆菌分别作为真核生物和原核生物常用的模式生物，用于代谢通路的构建。这两种生物都具有遗传背景清晰，便于基因操作的优势。相对于大肠杆菌而言，酿酒酵母具有额外的优势。利用微生物重新构建生物合成途径生产高价值的化合物越来越受到关注，目前，利用基因工程菌生产β-胡萝卜素已经成为当今研究的热点。3育种方案3.1β-胡萝卜素高产菌株的诱变选育3.1.1出发菌株三孢布拉霉(Blakesleatrispora)CCTCC(＋)(－)菌。3.1.2培养基（1）斜面培养基土豆20%、葡萄糖2%、KH2PO40.05%、酵母浸粉0.1%、琼脂2%，pH值6.5~7.2（121℃灭菌20min）。（2）种子培养基玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉2.3%、KH2PO40.15%、MgSO4.7H2O0.01%、豆油0.5%、工业玉米浆1%、pH值自然，500ml三角瓶装100ml(121℃灭菌20min)。（3）发酵培养基玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.4%、KH2PO40.25%、MgSO4.7H2O0.02%、豆油3.5%、工业玉米浆2.0%、VB10.005%、柠檬酸三钠0.3%，pH值7.0（121℃灭菌20min）。3.1.3诱变方法3.1.4单孢子悬液的制备三孢布拉霉接种于4°麦汁平板，25℃培养6-7天，使孢子成熟，从孢子囊中散出。采用分散法制备菌悬液，用镊子将平板上的菌丝连孢子一起取出放于装有玻璃珠和添加0.05%乳化剂OP的生理盐水的三角瓶中充分振荡后过滤，即制成菌悬液，视颜色深浅作一定稀释，控制孢子浓度106个/mL左右。3.1.5诱变处理在黑暗条件下进行紫外线照射，先预热约30min，取5mL制备好的单孢子悬液置一直径为6cm的培养皿中，将其放置在离紫外灯30cm（垂直距离）处的磁力搅拌器上，分别照射2，4，6，8，10，12min。将照射后的孢子悬液暗培养4h后，作一定的梯度稀释，然后分别涂布于麦汁平板上，于27℃暗培养待长出单个菌落计数。取未经紫外线处理的菌悬液稀释涂于麦汁平板上作为对照。3.1.6诱变剂及诱变剂量的选择紫外线是一种使用方便且诱变效果较好的物理诱变剂，其生物学效应主要是由于它能引起DNA链的断裂、DNA分子内部和分子间的交联、核酸及蛋白质的交联、嘧啶水合作用以及形成嘧啶二聚体，妨碍了碱基的正常配对，从而引起生物体的基因突变或死亡。采用不同时间的紫外线照射处理三孢布拉霉孢子，以照射时间为横坐标，致死率为纵坐标，作紫外线的致死曲线。致死率（%）=（未经处理的菌落数/mL-紫外照射后菌落数/mL）/(未经处理的菌落数/mL)×100。一般认为照射的剂量致死率控制在70%-80%时诱变效果好，并且有研究证明采用紫外线照射剂量为8min(致死率为81%)ADDINNE.Ref.{71658B08-5A75-4538-A8DD-C0898EB33BAF}[21]。3.1.7突变株的选育3.1.7.1初筛筛选培养基1：麦汁5°，琼脂2.5%，β-紫罗酮（事先用少量乙醇溶解）；筛选培养基2：麦汁5°，玉米浆粉0.1%，琼脂2.5%，洛伐他汀；筛选培养基3：麦汁5°，玉米浆粉0.1%，琼脂2.5%，二苯胺（事先用少量乙醇溶解，乙醇在培养基中的终浓度不得超过0.4mg/mL）；将诱变后孢子分别涂布筛选平板1、2、3，将分离出颜色较黄，孢子较丰富的单菌落于斜面培养基上进行扩大培养，再分别接入种子培养基（100mL/500mL），27℃，180r/min培养44h，以15%（V/V）接种量转入发酵培养基（25mL/250mL），27℃、180r/min培养120h。测菌丝体中β-胡萝卜素含量。3.1.7.2复筛挑选一定量的初筛最佳菌种，接于摇瓶进行复筛，复筛条件及方法同初筛。3.1.7.3遗传稳定性试验将复筛得到的菌株连续传代7次，每代均经摇瓶发酵后测定β-胡萝卜素含量，重复3次。3.2代谢工程改造酿酒酵母高产β-胡萝卜素3.2.1生产菌种酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）3.2.2β-胡萝卜素生物合成路径的设计及优化现在企业用于生产β-胡萝卜素的微生物主要还是E.coli、S.cerevisiae等，在这些微生物当中构建β-胡萝卜素合成途径通常包括3个功能相对独立的模块：糖酵解模块、前体物质合成模块和β-胡萝卜素合成模块。图2β-胡萝卜素生物合成途径Fig.2β-carotenebiosynthesispathways.G3P:glyceraldehyde-3-phosphate;DXP:1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate;MEP:2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate;IPP:isopentenyldiphosphate;DMAPP:dimethylallyldiphosphate;FPP:farnesyldiphosphate;GGPP:geranylgeranyldiphosphate;HMG-CoA:3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeA;dxs:1-deoxyxylulose-5-phosphatesynthase;dxr:1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase;ispD:4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-Derythritolkinase;ispE:4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-Derythritolsynthase;ispF:2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphatesynthase;ispG:1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl4-diphosphatesynthase;ispH:4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphatereductase;idi:isopentenyldiphosphateisomerase;ispA:geranyltranstransferase;crtE:GGPPsynthase;crtB:phytoenesynthase;crtI:phytoenedesaturase;crtY:lycopenecyclase;atoB:acetoacetyl-CoAthiolase;mvaS:HMG-CoAsynthase;mvaA:HMG-CoAreductase;mvaK1:mevalonatekinase;mvaK2:phosphomevalonatekinase;mvaD:diphosphomevalonatedecarboxylase.(1)利用MEP途径合成异戊二烯焦磷酸（IPP）大肠杆菌跟其他原核生物通过MEP途径为β-胡萝卜素的合成提供了前体物质IPP。甘油和葡萄糖利用糖酵解（EMP）途径产生甘油醛-3-磷酸（G3P）以及丙酮酸，它们在1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(Dxs)的作用下形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，再经过一系列类异戊二烯酶：4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(IspF)、4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸还原酶(IspH)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸合成酶(IspG)、DXP还原异构酶(Dxr)和4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(IspD)，将DXP转化为C5异戊二烯亚单位——二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）和IPP，这两种物质通过异戊烯焦磷酸异构酶(Idi)相互转化。（2）利用MVA途径合成IPP植物和真核生物的线粒体等通过利用MVA途径提供前体物质。MVA途径通常可以分为上游和下游两个部分。上游途径通过HMG-CoA还原酶(MvaA)、HMG-CoA合成酶(MvaS)和乙酰辅酶A硫解酶(AtoB)三种酶将三分子的乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)转化成为甲羟戊酸(MVA)；而下游途径通过二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MvaD)、磷酸甲羟戊酸激酶(MvaK2)和甲羟戊酸激酶(MvaK1)3种酶通过MVA途径转化形成IPP。整个MVA途径的起点开始于细胞中丰富的乙酰CoA，而且可能比MEP途径供应的IPP效率更高，通过在E.coli中引入外源MVA途径能够有效避免细菌本身的反馈抑制，从而产生大量的异戊二烯化合物。（3）β-胡萝卜素合成模块并且优化野生菌——三孢布拉氏霉菌、成团泛菌以及欧文氏菌中都含有β-胡萝卜素的结构基因：crtEYIB基因簇。通过利用基因工程技术将基因簇整合到模式生物的染色体上，从而实现由前体到β-胡萝卜素的转化。FPP是其他类异戊二烯分子和类胡萝卜素生物合成的共同分支点和前体物，由ispB编码的八聚异戊二烯焦磷酸合成酶催化FPP形成泛醌，从理论上来说，ispB基因的表达会将代谢流量更多地引向泛醌的合成方向，但结果令人吃惊的是，过表达ispB反而会导致β-胡萝卜素合成产量的增加。由图2当中可以看出，过表达磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(Pps)来控制丙酮酸和G3P的代谢流平衡之后，都能够明显地提高β-胡萝卜素的产量。而且因为丙酮酸是糖酵解途径（EMP）重要产物，生物体内的主要代谢物，参及了许多的生理代谢反应，因此，如果要使代谢流尽可能多地流向β-胡萝卜素合成方向，则必须要减少副产物，如：乙酸和乳酸的形成ADDINNE.Ref.{B254A5AC-BCFF-4319-984A-2429B9FB0B47}[33]。3.3基因工程改造酿酒酵母高产β-胡萝卜素3.3.1质粒载体的选择一些质粒DNA编码的表型为基因工程提供了很好的选择标记。质粒DNA可以通过人工转化过程将其导入细菌之中。然而即使在最佳条件下，也只有少数细菌能够稳定地接受质粒。而要鉴定哪些细菌细胞接受了转化体，就需要利用质粒编码的可选择标记。这些标记可产生一种新的表型，因此，可以把转化成功的细菌挑选出来。由图2可以得出，异戊二烯焦磷酸(IPP)作为β-胡萝卜素的前体物质，我们可以通过提高IPP的合成来提高β-胡萝卜素含量。过表达类异戊二烯关键基因如dxs和idi。Dxs和Idi被认为是类异戊二烯合成途径的限速步骤，一般通过基因修饰来增加这两个酶的活性；抑制竞争路径异戊二烯焦磷酸的利用，减弱或敲除旁路代谢过程。由于编码GGPP合成酶的基因crtE具有序列多样性，所以在β-胡萝卜素合成结构基因的起始处应当选择一个较为有效的crtE基因。RNAi(RNAinterference)的出现，使生物合成途径上某些基因如β-胡萝卜素酮化酶、羟化酶基因沉默，阻断β-胡萝卜素的迚一步代谢，使之在细胞内积累。ADDINNE.BibReferences:[1]. 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