DB15-T 3609-2024 黑土地土壤微生物肥力评价规范

65.020.01CCS

B

1015 DB15/T

3609—2024黑土地土壤微生物肥力评价规范

for

of

soil

microbial

fertility

in

blacksoil2024-07-22

发布2024-08-22

实施内蒙古自治区市场监督管理局 发

布DB15/T

3609—2024 本文件按照GB/T

1.1—2020《标准化工作导则

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会

20)归口。牧厅综合保障中心。文、赵靖丹、马超、刘亚萌、董子涵、李晓彦、白嘉骏、王旭、冬梅。单位土壤中体积小于5

μm

×10

μm

单位土壤中体积小于5

μm

×10

μm

1范围力评价指标及测定，土壤微生物肥力评价方法等技术要求。本文件适用于黑土地土壤微生物肥力高低的评价。2 规范性引用文件文件。GB/T

化学试剂

标准滴定溶液的制备GB

20287-2006 农用微生物菌剂GB/T

耕地质量等级HJ

613

干物质和水分的测定

重量法LY/T

1220 森林土壤呼吸强度的测定NY/T

土壤检测

第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。土壤微生物肥力 soil

fertility能对土壤的物理和化学特性起到促进和维持作用的微生物，在生物过程中为植物生长发育提供所需养分的能力。土壤微生物生物量 soil

microbial

biomass33 3土壤呼吸强度 soil

intensity单位时间内从单位面积土壤中释放出来的二氧化碳量。4 土壤样品的采集、制备及基础指标测定用定位仪确定采样地点的地理位置（经纬度），每个样地面积原则上应＞1

hm

，在平原区地形宜DB15/T

3609—2024用定位仪确定采样地点的地理位置（经纬度），每个样地面积原则上应＞1

hm

，在平原区地形宜采样时间土壤微生物取样宜在植物生长旺盛期采样。内蒙古东北区采集时间宜选择在

7～8

月初进行，在野外采样时，应根据区域天气和农业管理条件的变化，避开降雨、施肥和灌溉等时期。采样方法4.2.1 样地设置2设置为

100

m×100

m

正方形，在丘陵山区狭长地带宜选择

50

m×

m

的长方形。4.2.2 采样单元确定式、气候条件、耕作以及施肥方式等将所评价样地划分为

3

个条件相对一致的采样单元。4.2.3 样品采集的不锈钢土钻随机采集15～20个0

～

cm以

1

左右为宜，若采集的样品量过多时，可用四分法（按照

NY/T

的规定执行）将多余的土壤弃去，最后保留

1

kg

左右。每个样地分别采集

3

个微生物混合样作为重复。样品处理4.3.1样品保存4

存有土样的4

℃冷藏箱或者冰袋在48

h内运回实验室，并统一保存于4

℃环境中。4.3.2 样品制备10目标准筛，选取一定量的土样用四分法过

目标准筛，用于土壤有机碳含量的测定。土壤含水量和有机碳的测定土壤含水量的测定按照HJ

613的规定执行，土壤有机碳的测定按照GB/T

中附录C定执行。5 土壤微生物肥力评价指标及测定土壤微生物肥力评价指标微生物熵计算如公式(1)：SMBC=C/C

…………………(1)DB15/T

3609—2024式中：qSMBC

——微生物熵；Cmic

微生物生物量碳；Corg

土壤有机碳。评价指标的测定5.2.1 微生物数量测定

20287-2006中6.3.2及其配制方法分别按照GB

20287-2006的附录A中A.1、A.6落数。5.2.2 微生物生物量测定5.2.2.1 微生物生物量碳土壤微生物生物量碳测定具体方法见附录AA.1。5.2.2.2微生物生物量氮土壤微生物生物量氮测定具体方法见附录AA.2。5.2.3 土壤酶活性测定5.2.3.1 纤维素酶活性纤维素酶活性测定按照GB

20287-2006的附录D中D.1的规定执行。5.2.3.2蔗糖酶活性蔗糖酶活性以蔗糖为底物，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定，具体方法见附录B中的。5.2.3.3 脲酶活性脲酶活性以尿素为底物，采用苯酚钠‒次氯酸钠比色法测定，具体方法见附录B中的。5.2.3.4 磷酸酶活性磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，具体方法见附录BB.3。5.2.3.5 过氧化氢酶活性过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，具体方法见附录B中的。5.2.3.6 硝酸还原酶活性硝酸还原酶活性采用酚二磺酸比色法测定，具体方法见附录

B

B.5。5.2.3.7 多酚氧化酶活性多酚氧化酶活性采用底物（左旋多巴（L-DOPA））分光光度法测定，具体方法见附录

B

中的

。5.2.4土壤呼吸强度的测定DB15/T

3609—2024土壤呼吸强度测定按照

1220的规定执行。6土壤微生物肥力评价方法确定各评价指标权重参照表1规定的层次分析法，建立目标层、准则层和指标层层次结构，构建判断矩阵。经层次单排肥力(目标层)相对重要性的排序权重值。具体方法按照GB/T

33469的规定执行。表1 黑土地土壤微生物肥力评价因子总集𝑓(𝑢)

=

{𝑓(𝑢)

=

{𝑢0

,

𝑢

<

𝑢0计算各指标隶属度土壤微生物数量、微生物生物量碳氮、微生物熵及酶活性均属于S型隶属函数，各评价因素的隶属函数可简化为公式：𝑢1, 𝑢

≥

𝑢0

…………………式中：𝑓(𝑢)

——隶属函数；𝑢

——评价指标；𝑢0

——评价指标的阈值上限值。6.2.2 隶属函数阈值上限的确定采用累积频率曲线确定隶属函数阈值上限，一组样本u1,u2,...un，给定某一阈值u0，不大于u0的样本数为m为不大于u0的指标值作为隶属函数的阈值上限。土壤微生物肥力指数模型采用主成分分析法确定单项评价指标的权重值Ci指标的隶属度Fi评价指标构成的土壤微生物肥力综合评价。土壤微生物肥力指数模型如公式：DB15/T

3609—2024MIF

=

（𝐶𝑖

×

𝐹𝑖）…………………式中：MIF土壤微生物肥力综合指数；𝐶𝑖

——第i个评价指标的组合权重；𝐹𝑖

——第i个评价指标的隶属度。土壤微生物肥力综合评价根据6.2.2确定的阈值上限，利用公式计算各个土壤样品的隶属度值。然后应用公式(3)中所建0～1之间。壤微生物肥力水平越高。DB15/T

3609—2024

附 录 A（资料性）微生物生物量测定A.1 土壤微生物量碳的测定A.1.1 方法原理新鲜土样经氯仿熏蒸24

h土壤微生物量碳。A.1.2 试剂配制A.1.2.1 去乙醇氯仿（CHCl3

1:2

的比例置入分液漏斗中，充分震摇

1min

3

无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在

4

℃、黑暗条件下保存。注意：氯仿具有致癌作用，所有操作应在通风橱中进行。A.1.2.2氢氧化钠溶液（1

mol/L）：称取

40

g（精确至

0.01

g）氢氧化钠，用水溶解，定容至

mL。A.1.2.3 0.5

mol/L）：称取

g（精确至

0.01

g于

2.5

L

2

L150

r/minA.1.2.4 重铬酸钾标准溶液（

mol/L）：称取

12.26

g（精确至

g）重铬酸钾（优级纯）溶于

～

水中，加水定容至

1000

mL。A.1.2.5 0.05

mol/L）：称取

14

g（精确至

0.0001

g

600

mL～800mL

水中，加浓硫酸

5

mL

搅拌均匀，静止片刻后定容至

1000

mL每次使用时应标定其准确浓度。A.1.2.6

1.49

g（精确至

0.0001

g

g（精确至

g）硫酸亚铁或

1

g（精确至

0.0001

g

100

mL

水溶液中。A.1.3 仪器设备0.0001

g和0.01

g180

5

℃)25

℃±1

℃)，摇床（25

℃，

r/min，300

r/minA.1.4 水分测定按照HJ

613测定土壤样品的干物质含量。A.1.5 样品测定新鲜土壤应立即处理或保存于4

()及土壤动物(如蚯蚓等)2

mm免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜）。如果土壤过于干燥，用水调节含水量至田间持水量的40%。将土壤置于密封的塑料桶内，在25

℃±1

℃下预培养7

d～15

d。桶内有适量水以保证相对湿度为100%，并在桶内放一小烧杯1

溶液以吸收土壤呼吸产DB15/T

3609—2024生的CO2。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响以及植物残体对测定的干扰。经预培养的土壤应立即分析，否则，应置于4

℃下保存，且分析前需在上述条件下至少再培养24

h。A.1.6 熏蒸称取经预处理的土壤50.00

g共3

盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（

大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯1

mol/LNaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2-0.07

氯仿剧烈沸腾3

min～5

。关闭真空干燥器阀门，于25

℃

黑暗条件下熏蒸24

h。打开干燥器蒸。-0.07

Ma抽真空5～6次，每次3

，每次抽真空后最好完全打开干燥器，以加快去氯仿速度和效果。在熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为对照土壤。A.1.7 浸提将熏蒸后的土壤无损转移到200

mL聚乙烯塑料瓶中，加入100

mL

mol/L硫酸钾浸提剂，使土水比为（土壤为质量单位g，浸提液为体积单位mL），振荡（25

℃,300

r/min）浸提30

，用中速定量滤纸过滤于

mL塑料瓶中。另称取等量的3份对照土壤于

mL聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100mL

mol/L硫酸钾浸提剂同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白，过滤后的浸提液应立即分析，或在

℃下保存。A.1.8 测定取10

mL

0.2500

mol/L重铬酸钾标准溶液，5.00

再将铁丝笼沉入加热至

℃～

185

℃

的油液。把试管内的消煮液无损地转入

三角瓶中，用水冲洗试管及小漏斗，洗液并入三角瓶中，使三角瓶内溶液的总体积控制在50

mL～60

3滴邻菲啰琳指示剂，用硫酸亚铁标准溶液滴定剩余的重铬酸钾，溶液的变色过程是橙黄--棕红，即为终点。记录硫酸亚铁滴定量。A.1.9 结果计算样品中有机碳含量以克每千克（g/kg）表示，按式（A.1）计算：𝑚×𝑓

×1000×𝑉𝑚×𝑓

×1000×𝑉1

…………………(A.1)

100式中：C

——样品中有机碳的含量，单位为克每千克（）；C

——硫酸亚铁标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（moL/LV0

空白试验所消耗硫酸亚铁标准溶液体积，单位为毫升（mLV

——试样试验所消耗硫酸亚铁标准溶液体积，单位为毫升（mLDB15/T

3609—20240.003

——1/4碳原子的毫摩尔质量，单位为克每毫摩尔（g/mmol1.10

——氧化校正系数；m

——称取土壤的质量，单位为克（gf

——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%V1

——用于测定的浸提液体积，单位为毫升（mL土壤微生物量碳含量以克每千克（g/kg）表示，按式（）计算：𝐵𝑐

=

𝐸𝑐

÷𝑘

…………………(A.2)式中：Bc

土壤中微生物量碳的含量，单位为克每千克（g/kg）；Ec

熏蒸土壤浸提测定的有机碳－不熏蒸土壤浸提测定的有机碳，单位为克每千克（g/kg）；K

——转换系数，取值。结果保留三位有效数字。A.1.10 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的。A.2 土壤微生物量氮的测定A.2.1 方法原理新鲜土样经氯仿熏蒸24

h微生物量氮。A.2.2 试剂配制A.2.2.1 去乙醇氯仿（CHCl3）：同

A.1.2

中的去乙醇氯仿制备。A.2.2.2 氢氧化钠溶液（1

mol/L）：称取

40

g（精确至

0.01

g）氢氧化钠，用水溶解，定容至

mL。A.2.2.3 0.5

mol/L）：称取

g（精确至

0.01

g于

2.5

L

2

L150

r/minA.2.2.4 氢氧化钠溶液（400

g/L）：称取

400

g

氢氧化钠加水溶解，定容至

1

L。A.2.2.5 硼酸溶液（20

）：称取

20

g

硼酸加水溶解，定容至

1

L。A.2.2.6 硫酸标准溶液（0.02

mol/L

5.56

浓硫酸缓缓注入

mL

水中，用水定容至1000

mol/L

GB/T

601

5

倍得到

0.02

的硫酸标准溶液。A.2.2.7 指示剂：称取

0.10

g

甲基红和

0.50

g

溴甲酚绿指示剂放入玛瑙研钵中，加入

100

mL

乙醇研磨溶解。A.2.3 仪器设备电子天平（感量0.0001

g和0.01

g），真空泵，恒温培养箱（25

℃±1

℃)，凯氏定氮仪，摇床（25

℃，

r/min，

r/min）。A.2.4 水分测定DB15/T

3609—2024同A.1.4。A.2.5样品测定同A.1.5。A.2.6 熏蒸同A.1.6。A.2.7 浸提同A.1.7。A.2.8 消化取10.0

mL浸提液（解冻的浸提液在取样前应彻底混匀）于250

消化管中，加入0.100

g硫酸铜，5

mL浓硫酸，于电炉上消化，混合液消化变清后再回流3

h。A.2.9 测定15

25

g/L硼酸吸收液和指示剂3滴。然后向消化管缓缓加入35

mL

氢氧化钠溶液，蒸馏5

，用少量蒸馏水冲洗冷凝管的下0.02

mol/L准硫酸溶液的毫升数。A.2.10 结果计算样品中氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（）计算：𝑚×𝑓

×

1000×𝑚×𝑓

×

1000×𝑉2

…………………(A.3)

100式中：N

——样品中氮的含量，单位为克每千克（g/kgV1

滴定样品时消耗硫酸标准溶液的毫升数，单位为毫升（mLV0

滴定空白时消耗硫酸标准溶液的毫升数，单位为毫升（mLc

——硫酸标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（moL/L0.014

——氮原子的毫摩尔质量，单位为克每毫摩尔（g/mmol）；m

——表示称取土壤质量，单位为克（g）；f

——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%V2

用于测定的浸提液体积，单位为毫升（mL土壤微生物量氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（）计算：𝐵𝑐

=

𝐸𝑐

÷𝑘

…………………(A.4)式中：Bc

土壤中微生物量氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；Ec

熏蒸土壤浸提测定的氮含量－不熏蒸土壤浸提测定的氮含量，单位为克每千克（g/kg）；K

——转换系数，取值。结果保留三位有效数字。DB15/T

3609—2024A.2.11 精密度同A.1.10。10DB15/T

3609—2024

附 录 B（资料性）土壤酶活性的测定B.1 土壤蔗糖酶活性测定B.1.1 方法原理土壤蔗糖酶将蔗糖酶促水解为还原糖，还原糖与二硝基水杨酸在沸水浴中反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸，颜色深度与还原糖量呈正相关，因而可用还原糖量来表示蔗糖酶的活性。B.1.2 试剂配制具体如下：a)

甲苯（C7H8）；b)

蔗糖（C12H22O11c)

磷酸氢二钠（d)

磷酸二氢钾（KH2PO4）；e)

葡萄糖（f)

3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7g)

酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2Oh)

酶促反应试剂：1)

蔗糖水溶液（80

g/L）：称取

8.00

g

100

mL；2)

磷酸缓冲液（pH

5.5）；3)

g

二水合磷酸氢二钠用水溶解定容至

1

L（A

氢钾溶液：称取

9.078

g

磷酸二氢钾用水溶解定容至

1

L（B

液）；取

A

液

mL，B

液9.5

混合均匀即可。i)

1

mg/mL

100

℃干燥

2

h

50

mg

mL

4

℃冰箱中保存期不超过

7d）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制；j)

3,5-

试剂）：称取

0.50

g3,5-二硝基水杨酸，溶于

20

mL

2

mol/L

氢氧化钠溶液中再加入

50

水，再称取

30

g

酒石酸钾钠，溶于上述溶液中，用水定容至

mL（保存期不超过

7

dB.1.3 仪器设备电子天平（感量0.0001

g和0.01

g），恒温培养箱，分光光度计。B.1.4 标准曲线绘制分别吸取1

mg/mL的葡萄糖标准液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50

mL于50

mL补加水至1

mLDNS试剂3

mL5

后立即于冷水浴中冷却至室温，用水定容至50

mL，以空白管调零在波长540

处比色，以吸光值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。B.1.5 测定步骤11

𝑚×𝑓×𝑡 …………………(B.1)DB15/T

3609

𝑚×𝑓×𝑡 …………………(B.1)B.1.5.1 水分测定按照HJ

613测定土壤样品的干物质含量。B.1.5.2 样品测定称取

5

g

土壤（精确至

0.0001

g

50

mL

具塞三角瓶中，加入

15

mL

80

蔗糖溶液，5

mL

pH5.5

磷酸缓冲液和

5

滴甲苯。摇匀混合后，放入恒温培养箱，在37

℃±1

℃下培养

h，取出迅速过滤。准确吸取滤液

1.00

mL，注入

50

mL

容量瓶中，加入

3

mLDNS

5

3

-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用水定容至

50

mL，在分光光度计上于

处进行比色。注意事项:a)

每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的水代替基质（80

蔗糖水溶液），其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的蔗糖、葡萄糖对实验结果的影响；b)

身分解，即空白试验；c)

如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。B.1.6结果计算蔗糖酶活性以

h，1

g

风干土壤可水解生成葡萄糖毫克数表示，按式（）计算：𝑋

=

(𝐶1−𝐶2)×𝑉×𝑁式中：X

——样品中蔗糖酶的含量，单位为毫克每克每24

h（mg/g·

h）；

——加基质样品由标准曲线求得的葡萄糖的含量，单位为毫克每毫升（）；

——未加基质样品由标准曲线求得葡萄糖的含量，单位为毫克每毫升（）；V

——显色定容体积，单位为毫升（mLN

——为分取倍数=浸出液体积（mL）／吸取滤液体积（mL）；m

——表示称取新鲜土壤质量，单位为克（g）；f

——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%t

——表示土壤培养时间，单位为24小时（24

h结果保留三位有效数字。B.1.7 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的

。B.2 土壤脲酶活性测定B.2.1 方法原理—常温条件下作用生成蓝色靛酚，颜色深度与生成氨的量呈正比，用比色法测定氨的量来表示脲酶活性。B.2.2 试剂配制B.2.2.1甲苯（C7H8）。B.2.2.2 尿素（CON2H4）。12DB15/T

3609—2024B.2.2.3 柠檬酸（C6H8O7）。B.2.2.4 氢氧化钾（KOH）。B.2.2.5 苯酚钠（C6H5ONa）。B.2.2.6 次氯酸钠溶液：根据市售次氯酸钠溶液浓度稀释试剂，至活性氯的浓度为

。B.2.2.7 尿素溶液（100

g/L）：称取

10

g

100

mL。B.2.2.8 檬酸盐缓冲液（pH

）：称取

g

柠檬酸和

147.50

g

并，用

1

mol/L

氢氧化钠将

pH

调至

6.7，用水定容至

1000

mL。B.2.2.9 苯酚钠溶液（1.35

mol/L）：称取

62.50

g

苯酚钠溶于少量乙醇，加

2

18.5

丙酮，用乙醇定容至

（A

27

g

mL（B

液）。将

A、B

溶液保存在

4

A

B

液各

20

混合，用水定容至

100

。B.2.2.10 氨的标准溶液：精确称取

0.4717

g

经干燥箱

105

℃烘干

3

h

硫酸铵溶于水并定容至

1000mL

1

mL

0.1

mg

0.01

mg/mL的工作液。B.2.3仪器设备电子天平（感量

0.0001

g

和

0.01

gB.2.4 标准曲线绘制在测定样品吸光值之前，分别吸取0.00、1.00、、5.00、7.00、9.00、、13.00

mL氨的标准溶液，移于50

容量瓶中，然后加水20

。再依次加入4

mL苯酚钠溶液和3

mL次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20

min0.0、0.2、0.6、1.0、、、、2.6

µg/mL的一组标准浓度。1

h内在分光光度计

波长处比色。然后以氨浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。B.2.5 测定步骤B.2.5.1 水分测定按照

测定土壤样品的干物质含量执行。B.2.5.2 样品测定称取

5

g

土样（精确至

0.0001

g

100

具塞三角瓶中，加入1

mL

甲苯，振荡均匀，

min

后加入

10

尿素溶液和

20

mL

柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在

37

1

℃恒温箱培养

24

h。培养结束后过滤，过滤后吸取

1.00

滤液至

50

容量瓶中，再依次加入

4

苯酚钠溶液和

3

mL

次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20

50

mL。1

h

内在分光光度计

578

1

h

注意事项:a)

与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响；b)

身分解，即空白试验；c)

如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。B.2.6 结果计算13

𝑚×𝑓×1000×𝑡

…………………(B.2)DB15/T

3609

𝑚×𝑓×1000×𝑡

…………………(B.2)脲酶活性以24

h，1

g风干土壤可水解生成氨量的毫克数表示，按式（）计算：X=

(𝐶1−𝐶2)×𝑉×𝑁式中：

——mg/g，24

h）；————

——显色定容体积（）；

——为分取倍数=浸出液体积（mL）／吸取滤液体积（mL）；

——表示称取新鲜土壤质量，单位为克（g）；

——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%）；

——表示土壤培养时间，单位为

小时（

h）。结果保留三位有效数字。B.2.7精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的。B.3 土壤磷酸酶活性测定B.3.1 方法原理剂反应生成蓝色，颜色深度与酚含量呈正相关，用比色法测定游离的酚含量来表示磷酸酶的活性。B.3.2 试剂配制具体如下：a)

甲苯（C7H8）；b)

冰醋酸（C2H4O2c)

无水醋酸钠（C2H3O2Na）；d)

柠檬酸（C6H8O7e)

磷酸氢二钠（Na2HPO4）；f)

四硼酸钠（Na2B4O7·2O）；g)

氢氧化钠（NaOH）；h)

硫酸铝（Al2(SO4)3i)

磷酸苯二钠（C6H5Na24j)

苯酚（C6H6O）；k)

氯代二溴对苯醌亚胺（C6H2Br2CLNOl)

醋酸盐缓冲液（pH

1)

醋酸溶液（0.2

mol/L）：准确移取

11.55

mL

冰醋酸用水溶解定容至

1

L；2)

醋酸钠溶液（

mol/L）：称取

16.40

g

无水醋酸钠用水溶解定容至

1

L；3)

准确移取

14.80

mL

0.2

mol/L

35.20

mL

醋酸钠溶液（0.2

mol/L）用水定容至

1

L。m)

柠檬酸盐缓冲液（pH

7.0）：1)

柠檬酸溶液（

mol/L）：称取

19.20

g

柠檬酸，用水溶解定容至

1

L；14DB15/T

3609—20242)

磷酸氢二钠溶液（

）：称取

53.63

g

七水合磷酸氢二钠或

71.70

g

十二水合磷酸氢二钠，用水溶解定容至

1

L；3)

准确移取

6.40

0.1mol/L

柠檬酸溶液加

43.60

0.2

mol/L

磷酸氢二钠溶液，用水定容至

100

mL。n)

硼酸盐缓冲液（pH

1)

硼砂溶液（0.05

mol/L）：称取

19.05

g

四硼酸钠，用水溶解定容至

1

L；2)

氢氧化钠溶液（0.2

mol/L）：称取

8.00

g

氢氧化钠，用水溶解定容至

1

L；3)

准确量取

mL

硼砂溶液（0.05

mol/L

23

mL

氢氧化钠溶液（0.2

mol/L）用水定容至

200

mL。o)

5

5.00

g

酸盐缓冲液溶解定容至

1

L；p)

氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取

0.125

g

氯代二溴对苯醌亚胺，用

10

mL

乙醇溶解，贮于棕色瓶中，放冰箱

4

℃冷藏保存。溶液颜色未变褐色之前均可使用；q)

硫酸铝溶液（3

g/L）：称取

3.00

g

硫酸铝，用水溶解定容至

1

L；r)

酚标准溶液（1

mg/mL1)

1

g（精确至

0.0001

g

1

L2)

酚工作液（0.01

mg/ml）：准确移取

10.00

酚储备液，用水定容至

1

L。B.3.3 仪器设备电子天平（感量

0.0001

g

和

0.01

gB.3.4 标准曲线绘制准确吸取0.00、1.00、、5.00、7.00、9.00、、13.00

mL酚工作液（0.01

mg/ml），置于50

mL5

缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后用水稀释定容至刻度，配成浓度为0.0、0.2、0.6、1.0、、、、

µg/mL的一组标准浓度。30

计上

nm处比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。B.3.5 测定步骤B.3.5.1 水分测定按照

测定土壤样品的干物质含量。B.3.5.2 样品测定准确称取

5

g（精确至

0.0001

g

mL

具塞三角瓶中，加入

mL

后，加入

20

mL

5

磷酸苯二钠溶液，仔细摇匀后放入恒温培养箱，37

1

℃下培养

24

h

后取出，在培养液加入

mL

3

硫酸铝溶液摇匀，并过滤。准确吸取3.00

滤液于

50

处比色。整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。B.3.6结果计算15

𝑚×𝑓×1000×𝑡…………………(B.3)DB15/T

3609

𝑚×𝑓×1000×𝑡…………………(B.3)磷酸酶活性以24

h，1

g风干土壤可水解生成酚的量（mg）表示，按式（B.3）计算：X=

(𝐶1−𝐶2)×𝑉×𝑁式中：——样品中磷酸酶的含量，单位为毫克每克每

小时（mg/g·24

h）；————

——显色液定容体积，单位为微升（mL）；

——为分取倍数=浸出液体积（mL）／吸取滤液体积（mL）；

——表示新鲜土壤质量，单位为克（g）；

——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%）；

——表示土壤培养时间，单位为

小时（

h）。结果保留三位有效数字。B.3.7 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的。B.4 土壤过氧化氢酶活性测定B.4.1方法原理在

4

所消耗的高锰酸钾标准溶液体积数来表示过氧化氢酶的活性。B.4.2 试剂配制B.4.2.1 甲苯（C7H8）。B.4.2.2 浓硫酸（H2SO4）。B.4.2.3过氧化氢（H2O2）。B.4.2.4 高锰酸钾（K24）B.4.2.5 0.2

mol/L

5.43

mL

400

mL

至

500

mL。置于

4

℃冰箱贮存。B.4.2.6 高锰酸钾标准溶液

c（2MnO4）=0.1

mol/L：称取

3.30

g

高锰酸钾，溶于

1050

水中，缓缓煮沸

，冷却，于暗处放置两周，过滤。贮存于棕色瓶中，并按照

GB/T

601

对其进行标定。B.4.2.7 过氧化氢水溶液（3

%

%过氧化氢溶液

25

mL，用水定容至

mL

3

%

4

mol/L

1.00

mL3

%过氧化氢溶液于

50

mL

三角瓶中，加入

5

mL

水，5

mL

0.1

mol/L

的高锰酸钾标准溶液标定，所消耗的体积数为

16.51

。16.51

mL3%3%B.4.3仪器设备电子天平（感量

0.0001

g

和

0.01

gB.4.4测定步骤16用于表示硝酸还原酶活性。其反应式如：NO3

→NO2

→NH2用于表示硝酸还原酶活性。其反应式如：NO3

→NO2

→NH2→4

。

𝑚×𝑓×𝑡

…………(B.4)B.4.4.1 水分测定按照

测定土壤样品的干物质含量。B.4.4.2 样品测定分别称取

5

g（精确至

0.0001

g

0.5

mL

4

℃冰箱中放置

30

25

℃冰箱贮存的

3%过氧化氢水溶液，充分混匀后，再置于

4

℃冰箱中放置

1

h。取出，迅速加入

25

mL

贮存于

4

℃冰箱的

0.2

硫酸溶液，摇匀后过滤。准确吸取

1.00

mL

滤液于

50

三角瓶中，加入5

mL

5

mL

0.2

mol/L

硫酸溶液，用

mol/L

高锰酸钾标准溶液滴定，滴定至紫色褪去出现浅粉色为终点。根据空白和样品的滴定差，求出相当于分解过氧化氢的量所消耗的高锰酸钾标准溶液。B.4.5 结果计算过氧化氢酶活性以1

h，1

g风干土壤所消耗0.1

mol/L高锰酸钾标准溶液的体积数来表示，按式（B.4）计算：X=

(𝑉0−𝑉)×𝑐式中：·h）；——样品所消耗的高锰酸钾标准溶液的滴定体积，单位为毫升（）；

——1/5

高锰酸钾标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（）；

——g）；

——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%）；

1

1

h）。B.4.6 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的

。B.5 土壤硝酸还原酶活性测定B.5.1 方法原理采用酚二磺酸比色法。在厌氧环境下，通过与酚二磺酸的蓝色反应，求出反应前后硝态氮量差值，- -+B.5.2 试剂配制B.5.2.1 1%KNO3溶液。B.5.2.2 1%葡萄糖。B.5.2.3CaCO3。B.5.2.4 铝钾矾饱和溶液。B.5.2.5 酚二磺酸：取

3

g

重蒸酚与

37

g(20.1

浓

H2SO4混合，在沸水浴上回流加热

6

h

即成或直接使用商品化试剂。B.5.2.6 10%

NaOH。B.5.2.7 KNO3标准溶液：精确称取

16.3052

g

重结晶

3溶于蒸馏水中并稀释至

1

mL

含

17硝酸盐还原酶活性以24

h后10

硝酸盐还原酶活性以24

h后1