2.2动物细胞工程课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第2章第2节

动物细胞工程

-动物细胞培养

动物细胞工程的发展历程1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。1951年，张明觉等发现了哺乳动物精子获能现象。1959年，试管家兔诞生。之后，多种试管动物相继出生。1958年，格登用非洲爪蟾进行体细胞核实验，同期，我国科学家童第周开展了鱼类细胞核移植工作。1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术。1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊1981年，埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞。我国科学家用这种细胞培育了小鼠。2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。P33动物细胞工程动物细胞培养动物细胞融合动物细胞核移植是动物细胞工程的基础从社会中来在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？通过细胞培养构建人造皮肤P43概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。一、动物细胞培养原理：细胞增殖培育的终点：细胞目录Contents1动物细胞培养的条件2动物细胞培养的过程3干细胞培养及其应用1动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件营养物质其他条件<<糖类氨基酸无机盐维生素无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境1动物细胞培养的条件营养葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等合成培养基（将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基）一般使用液体培养基（培养液）含有多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质天然成分P441动物细胞培养的条件无菌、无毒的环境无菌①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理②在无菌环境下进行操作定期更换培养液，以便清除代谢物无毒超净工作台1动物细胞培养的条件适宜的温度、pH和渗透压哺乳动物多以（36.5±0.5）℃温度：pH：多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4渗透压：需要考虑的一个重要环境参数气体环境O2:细胞代谢所必需的CO2：维持培养液的pH（95%空气和5%CO2

）CO2培养箱微生物培养中的作用不同（为自养型微生物提供碳源）2动物细胞培养的过程动物组织块用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液(用培养液）原代培养问题细胞分裂受阻（为什么？）悬浮生长的细胞贴壁生长的细胞密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等接触抑制解决传代培养分瓶2动物细胞培养的过程细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。培养皿培养瓶2动物细胞培养的过程

瓶壁上的细胞层数是：一层（或单层）贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。接触抑制分瓶培养解除方法癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞2动物细胞培养的过程将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。将分瓶后的细胞培养称为传代培养。传代培养:原代培养:在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。2动物细胞培养的过程【思考1】幼龄动物的细胞和老龄动物的细胞，哪个更易于培养？为什么？幼龄。因为其分化程度低，分裂能力强。2动物细胞培养的过程【思考2】用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理组织块，使组织块分散成单个细胞的目的是什么？①使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需的O2和营养物质的供应，另一方面保证细胞内代谢废物的及时排出；②使得在细胞水平操作的其它技术得以实现。2动物细胞培养的过程【思考3】用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？【思考4】胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？主要是蛋白质(胶原蛋白等)。能，应注意时间的控制。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间还会分解膜蛋白，对细胞造成损伤。【思考5】能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。2动物细胞培养的过程【思考6】整个过程中用胰蛋白酶处理几次？作用分别是？第一次处理的目的是使组织细胞分散开；第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。原代培养视频演示传代培养视频演示1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，増殖能力越强，所以更容易培养。思考∙讨论思考∙讨论2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？培养结果动物血清植物激素常用液体培养基常用固体培养基培养基性质细胞的全能性原理动物细胞培养植物组织培养比较项目新的细胞群，不形成个体完整植株培养基特有成分细胞增殖P453干细胞培养及其应用【任务1】阅读教材46页“干细胞培养及其应用”的内容，思考、回答下列问题：什么是干细胞？它有哪些类型？这些类型各有怎样的特点和哪些方面的应用？P46干细胞概念大多数生物学家和医学家认为干细胞是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞。存在于早期胚胎、骨髓和脐带血。干细胞的种类胚胎干细胞成体干细胞存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。是成体组织或器官内的干细胞，具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。①干细胞的类型和特点胚胎干细胞简称ES细胞心肌细胞神经细胞造血干细胞分化分化分化体外培养①干细胞的类型和特点成体干细胞造血干细胞血细胞神经系统中神经干细胞精原干细胞神经细胞精原细胞骨髓、外周血和脐带血中睾丸中分化分化分化①干细胞的类型和特点②干细胞的应用干细胞有着自我更新能力及分化的潜能，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用正常干细胞患者体内受损的器官或组织治愈疾病修复或替换移植②干细胞的应用正常造血干细胞患者体内受损的血细胞白血病修复或替换移植造血系统、免疫系统功能障碍疾病正常神经干细胞患者体内受损的神经组织修复或替换移植治疗治疗神经组织损伤和神经退行性疾病（帕金森病/阿尔茨海默）3干细胞培养及其应用【任务2】胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用，有什么更好的办法呢？3干细胞培养及其应用【资料】2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。①iPS细胞的诱导及其流程病人各种类型的细胞导入特定基因导入特定蛋白小分子化合物成纤维细胞T细胞B细胞iPS细胞分化取出移植②iPS细胞应用的优点（1）诱导过程无需破坏胚胎（2）iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥。所以，科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。取成纤维细胞等转入相关因子细胞发生转化iPS细胞分化移植一、概念检测1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。(1)培养环境中需要O2，不需要CO2。()(2)细胞要经过脱分化形成愈伤组织。()(3)培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。()(4)培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。()练习与应用××√×P472.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是()A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞B.造血干细胞可以分化为各种血细胞C.不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的D.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用练习与应用A二、拓展应用现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。(1)由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HA(HumanLeukocyteAntigen，人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。二、拓展应用(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。动物细胞融合技术概念：是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。011.动物细胞融合技术

1.1原理：细胞膜具有一定的流动性1.2融合细胞的特点：具有两个或多个细胞的遗传信息，通过动物细胞的培养，杂交细胞表现出亲本的特点。1.3诱导动物细胞融合的常用方法：化学法：聚乙二醇（PEG）融合法物理法：电融合法生物法：灭活的病毒诱导法P481.动物细胞融合技术

灭活的病毒诱导法原理：病毒颗粒灭活的病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用细胞膜融合细胞核融合形成杂交细胞在病毒的作用下细胞膜打开相关信息能不能用不灭活的病毒呢？融合形成的杂交细胞最终有几个细胞核？1.动物细胞融合技术

19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。1.动物细胞融合技术

1.4动物细胞融合技术的优点：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。1.5动物细胞融合技术的应用：研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤细胞技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。P4802单克隆抗体及其应用2单克隆抗体的前世今生产量低、纯度低，而且特异性差B淋巴细胞不能无限增殖？血清分离每一个B细胞只分泌一种特异性抗体P49抗体种类超过百万种2单克隆抗体及其应用

把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。米尔斯坦【英国】科勒【德国】1.你从视频中了解到单克隆抗体具有哪些特点？2.请你尝试解释一下“单克隆抗体”一词的含义。特异性强、纯度高由单一细胞产生的只能识别一种抗原表位的特异性抗体。2单克隆抗体及其应用2.1单克隆抗体的过程：注射特定的抗原多种B细胞培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞将骨髓瘤细胞和B细胞融合多种杂交细胞杂交瘤细胞（既可以大量增殖又能产生抗体）筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能和特定的抗原结合）注射到小鼠腹腔内体外培养单克隆抗体诱导融合筛选P492单克隆抗体及其应用【两次筛选的比较】项目第一次筛选第二次筛选（需要多次筛选）筛选原因筛选方法筛选结果诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合的细胞等。用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。得到杂交瘤细胞因为小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞创新设计P372单克隆抗体及其应用【培养杂交瘤细胞的方法比较】项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高创新设计P361.ADC的抗体和药物各具有什么作用？P50思考讨论阅读课本50页“单克隆抗体的应用”资料1和资料2，回答以下问题：抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？可偶联抗肿瘤药物，如美登素。思考讨论3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；ADC能够协同发挥抗体特异性识別的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。2.2单克隆抗体的应用：（1）作为诊断试剂：（2）用于运载药物（3）用于治疗疾病利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。P49一、概念检测1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株练习与应用C2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体练习与应用A练习与应用二、拓展应用假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,日前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。从社会中来两只克隆猴在中国诞生从社会中来2017年我国科学家培育世界上首例体细胞克隆猴。1997年美国科学家从胚胎细胞“克隆了”两只猴子。动物细胞核移植1.克隆猴用到了什么技术？动物细胞核具有全能性2.为什么用供体猴的一个细胞核进行移植就可以培育出与它几乎一模一样的克隆猴？动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难3.胚胎细胞克隆猴与体细胞克隆猴有什么不同？为什么体细胞克隆猴的诞生能够轰动世界？P524.非人灵长类动物体细胞核移植非常困难的两个原因？【小结】哺乳动物核移植的类型及特点非人灵长类动物体细胞核移植非常困难的两个原因种类难易程度原因胚胎细胞核移植体细胞核移植较容易较难分化程度低，全能性易表现分化程度高，全能性难表现供体的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。【小结】用动物细胞核移植技术得到的动物称为克隆动物，是一种无性生殖。克隆动物供体：受体：结果：动物细胞核移植的概念理解动物的一个细胞的细胞核去掉核的卵母细胞形成重新组合的细胞并发育成新胚胎，继而发育成动物个体。目录Contents1动物体细胞核移植技术2体细胞核移植的应用前景及存在的问题01动物体细胞核移植技术动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术概念供体：受体：结果：动物细胞核移植的概念理解动物的一个细胞的细胞核去掉核的卵母细胞形成重新组合的细胞并发育成新胚胎，继而发育成动物个体。动物体细胞核移植技术1P52胚胎细胞核移植体细胞核移植类型原理细胞核的全能性动物体细胞核移植技术1动物体细胞核移植技术1【任务1】请结合教材用文字构建克隆高产奶牛的流程P53动物体细胞核移植技术-流程1从屠宰场收集牛卵巢，在体外培养到MⅡ期从供体高产奶牛身体某一部位取体细胞，进行培养通过显微操作去核将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞形成重构胚将胚胎移入受体（代孕）母牛体内生出犊牛（如电刺激、Ca2＋载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）用物理或化学方法激活重构胚动物体细胞核移植技术1【分析与探讨】1.体细胞和卵母细胞从哪里来？2.卵母细胞需要在体外培养到什么时期？3.在将供体细胞的细胞核移入卵母细胞前，需要对卵母细胞进行什么操作？为什么？卵母细胞从屠宰场收集牛卵巢体细胞来自于供体高产奶牛身体的某部位（如耳）上取MⅡ期去核保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞动物体细胞核移植技术1【分析与探讨】4.实际在克隆高产奶牛时，科学家并没有从供体细胞中取出细胞核，而是直接将供体细胞注入去核的卵母细胞，你知道这是为什么吗？这种方法操作简便，对卵母细胞损伤较小，伴随着两细胞融合，体现出细胞膜具有一定的流动性的结构特点。5.融合后的细胞可以直接发育成胚胎，继而发育成个体么吗？不可以，还需要利用胚胎工程中的胚胎移植等技术。动物体细胞核移植技术16.克隆出的小牛是对体细胞供体奶牛进行了100%的复制吗？动物的发育及一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，克隆动物所生活的环境与核供体动物生活的环境不会完全相同【分析与探讨】克隆动物遗传物质细胞核的DNA来自于供体动物的细胞核线粒体中的DNA供体细胞和受体卵母细胞生活环境：P5402体细胞核移植的应用前景及存在的