Sars病毒M,N,S蛋白的表达和细胞定位

1/1Sars病毒M,N,S蛋白的表达和细胞定位Sars－CovM，N,S蛋白的表达和细胞定位生命科学学院00级陆文摘要在获得Sars-Cov的结构蛋白S,M,N的cDNA的T-Easy克隆之后,通过限制性内切酶处理后连接到表达载体上,然后通过bac-to-bac杆状病毒表达系统,把结构蛋白的DNA转座到bacmid中,转染昆虫细胞,包装出第一代病毒后,用重组病毒感染昆虫细胞,从细胞中纯化到Sars-Cov的结构蛋白.由于在PCR的设计的引物中在DNA末端加入标记,可以利用标记的抗原性用westernblotting检验得到的纯化蛋白.在昆虫病毒感染重组病毒48h之后,免疫荧光制片,观察蛋白在细胞中的分布.同时,将克隆到荧光蛋白载体的M,N,蛋白和真核表达载体的S蛋白转染真核细胞,通过荧光蛋白的分布或免疫荧光确定M,N,S蛋白在真核细胞中的分步.关键词：

Sars-Cov,Sars-Cov结构蛋白,M,N,S蛋白,转染,westernblotting,免疫荧光。

前言冠状病毒科的成员只感染脊椎动物,与多种动物和人的疾病有关,本科病毒具有胃肠道,呼吸道和神经系统嗜性,分别引起相应的症候群.冠状病毒为多形态,略成球形,直径80-160nm.有囊膜.病毒囊膜由双层脂质组成,在脂质双层中穿插有两种糖蛋白:膜蛋白(M,又称E1)和纤突蛋白S(又称E2).囊膜表面覆有长12-24nm的突起(即纤突),纤突末端呈球状,由于囊膜纤突规则的排列呈皇冠状,冠状病毒的名称即由此而来.病毒粒子内部为RNA和核衣壳蛋白(N)组成的核蛋白核心,呈螺旋式结构,直径9-16nm.存在于病毒粒子囊膜上的糖蛋白具有不同的功能:M蛋白(20-30KD)是一种转膜糖蛋白,它通过3个疏水-螺旋区3次插入脂质双层,故其大部分(85%)位于囊膜内部,仅有N端糖基化的小部分暴露在囊膜的外面.M的功能类似正粘病毒,副粘病毒以及弹状病毒的非糖基化蛋白,在病毒装配期间将核衣壳连接到囊膜上,另外,抗M抗体在补体存在时可中和病毒感染性.S糖蛋白(180-200KD)大部分暴露在脂质层外面,是构成囊膜突起的主要成分.它由2个同样大小的多肽组成,S蛋白能直接与宿主细胞表面的受体结合,引起细胞融合,并具有诱导产生中和抗体和介导细胞免疫等功能.图1冠状病毒冠状病毒的基因组为不分段正股单链RNA,基因组大小为27-30KB,是所有RNA病毒中最大的.该RNA具有感染性,5末端具有帽结构,3末端含有结合的polyA尾.在正股5末端的非编码区和负股5末端之间有明显的同源序列.比较不同mRNA基因之间的同源性发现,基因组RNA5末端序列与不同mRNA基因之间的序列有高度的同源性,都有UAAAC序列,在先导RNA序列与基因内部起始位点之间有7-18个核苷酸是相同的,这些序列的特点与冠状病毒的先导-引物转录有关.目前已经证实,冠状病毒基因组RNA具有很高的重组率,这一现象类似分节段的RNA病毒,如呼肠孤病毒.在感染过程中，冠状病毒和细胞的吸附过程主要与细胞表面的特异性受体及病毒的纤突有关.病毒侵入细胞的方式有二:一为细胞对病毒的吞饮,一为病毒囊膜和细胞膜的融合.冠状病毒在感染敏感细胞后,于胞浆内发生脱壳,随后正链基因组RNA活化,呈现mRNA的作用,首先指导早期翻译病毒特异性RNA聚合酶,由此复制出互补的负链RNA.在转录酶参与下,由负链RNA转录出正链RNA和许多编码病毒蛋白的mRNA,他们具有相同的3末端和65个核苷酸的5端先导序列,分别编码结构蛋白M,S,N和非结构蛋白(NS).核衣壳的装配发生在胞浆的病毒工厂(毒浆)内,并在内质网和高尔基体之间的囊状膜上出芽成熟.冠状病毒看来并不在细胞膜上出芽,虽然有时可在胞膜上内发现病毒特异性抗原.聚集在感染细胞胞浆空泡内的病毒粒子,借助空泡和细胞膜的融合或在细胞崩解时释放到细胞外.Sars(severeacuterespiratorysyndrome)病毒是一种新的冠状病毒,全基因组由29,727个核苷酸组成,具有11个开放阅读框,基因组结构与其它冠状病毒相似,基因序列与原先发现的冠状病毒的同源性不高.图2ORFa/b示意图SARS病毒基因组中总共找到了11个编码序列（CDS，codingsequence）,序列比对的结果显示从第250位核苷酸开始编码的,长度为7074个氨基酸的多肽预测的开放读码框1ab多聚蛋白，和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus，MHV)的相应片断很相似,根据已有的鼠肝炎病毒相应片断的知识,将预测的开放读码框1ab多聚蛋白又分成14个蛋白,其中包括依赖RNA的RNA聚合酶.另外一个CDS(开放读码框1a多聚蛋白)，就是预测的开放读码框1ab多聚蛋白的前4383个氨基酸.其它9个CDS中有4个在BLAST中找到了高度同源的序列,分别对应于S蛋白、M蛋白、E蛋白、和N蛋白.5个没有找到任何同源的序列.所以推定SARS病毒总共有23个蛋白质.N蛋白结合在一个已经确定的病毒RNA包装的信号上,引导螺旋状排列的核衣壳的装配.M定位在特殊的细胞质膜泡上面向细胞质的结构上,并且可以和E蛋白相互作用,帮助核衣壳从膜上出芽.在某些冠状病毒中,M蛋白的C端和核壳体相互作用形成一个核心结构.S蛋白也可以和M相互作用,使成熟的病毒粒子以膜泡的形势释放出去.S蛋白前体在宿主的细胞质中合成以后会被切成两个部分S1和S2,其中S1形成成熟蛋白的球状部分,具体的切割位点并不清楚.一般情况下冠状病毒的侵染过程需要宿主细胞膜受体的介导.受体识别位点位于S1的内部.S2形成成熟蛋白的棒状部分,包括一个Nhelix、一个MHelix、一个CHelix和一个跨膜区.S1和S2之间通过分子间作用力相互结合,其结合位点可能有多个.S2的跨膜区把整个Spike蛋白固定在病毒的囊膜上,当S1通过受体结合位点和宿主细胞膜受体结合以后会导致S1和S2之间的分子间结合力减弱,S1和S2分离.暴露出S2上的3个helix,NHelix,MHelix和CHelix可以穿过宿主细胞膜,使得病毒的囊膜和宿主细胞膜发生融合.S1和S2之间结合力的强弱是影响冠状病毒倾染性强弱的重要因素之一.特殊情况下,如pH增高的时候,S1和S2之间的相互作用被削弱,在没有受体作用的情况S1和S2也能分离,S2进一步介导病毒和细胞的融合(Kruegeretal.,2000).Spike蛋白的受体属于一个叫做carcinoembryonicantigen-celladhesionmolecules(CEACAMs)的多向性家族(pleiotropicfamily),这是一个包含很广泛的分子家族,在多种细胞中均有表达.图3.S1和S2蛋白材料和方法:1.结构蛋白表达载体的构建和转座(invitrogen公司提供的杆状病毒表达系统)图4pFASTBACTMdonor质粒图谱将克隆在T-Easy载体上的结构蛋白的cDNA片段用限制性内切酶双切,连接到HTbdonorplasmid上,然后将结构蛋白的DNA转座到Bacmid中.1)做DH10Bac的感受态细胞.2)将已经构建好的结构蛋白的HTb表达载体3L加入50L感受态中,置于冰上30min3)热激,42C45sec.4)置于冰上2min.5)加入900LLB培养基(不含抗生素),37C摇床上225rpm培养4h以上.6)在含有三种抗性Kan涂版,同时加入IPTG和X-gal,做蓝白斑筛选.7)37C温箱中培养48h以上8)挑选白色的单菌落,置于Kan过夜.9)离心菌液1.5ml,倒干培养基,加入SolutionI300ul,涡旋振荡;加入SolutionII300ul,缓慢混匀,室温10min;加入SolutionIII300ul,缓慢混匀,冰上10min.10)14,000rpm10min,吸上清,加800ul异丙醇,缓慢混匀,冰上10min.11)14,000rpm,15min,弃上清,用500ul70%乙醇洗一次.12)14,000rpm,5min,弃上清,干燥,加入20ulTE(无Rnase),存于4C.13)用M13丝状噬菌体的引物,PCR检验所提质粒是否为阳性.Bacmid质粒1ulH2O23ulTaq10xbuffer3uldNTP2ulM13F0.5ulM13R0.5ulTaq0.25ul+,Tet+,Gen+LB固体培养基上,将转换产物稀释到10-2+,Tet+,Gen+三抗性的LB液体培养基中,摇菌30ulPCR循环设计:94C--94C--55C--72C--72C--4C5min30s30s3min7min30cycles没有转座的bacmid作为对照,最后电泳出现300bp条带,阳性质粒的条带应该为2.4kb+结构蛋白DNA的bp数.图5.转座位点2.SF9细胞的培养SF9细胞在含有10%的胎牛血清(已灭活)的昆虫培养基(TNM-FH)中置于27C,无CO2的生化培养箱中培养.当SF9长到50-70%,即可用于转染.3.转染1)在无菌的tube中加入:5ul已经鉴定的转座了结构蛋白的Bacmid+90ulSF培养基+5ul脂质体,室温放置15min以上2)SF9细胞用SF培养基(不含血清)洗三次,最后加入1ml的SF培养基,然后逐滴加入脂质体混合物,混匀,覆盖细胞3)27C培养5h以上,加入10%FBS的新鲜培养基5ml4)27C培养72h,上清中含有重组的杆状病毒,可用于下一步的接毒.4.接毒传代扩增大量的SF9细胞,除去旧的培养基,加入含有10%FBS的新鲜培养基后,在加入转染细胞上清液,27C无CO2培养48h-72h.5.从SF9接毒细胞中纯化带有6Xhis的SRAS结构蛋白1)细胞用无血清培养基洗一下,用10ml的SF培养基将细胞吹下来,收集到EP管中,称管重,离心去掉SF,再称重,收集细胞沉淀2)将细胞沉淀悬浮在suspensionbuffer中,15mlbuffer/每g细胞suspensionbuffer:Tris-HClpH8.550mM2-ME10mMNP-401%PMSF1mM3)轻柔的倒置5-10次4)13,000g除去细胞碎片5)收上清(粗提)6)500ul上清混合200ulNi-NTA树脂,4C,20min7)离心1000-1500rpm,1min8)用bufferA洗两次,每次6ml,洗去杂蛋白BufferA:Tris-HClpH8.520mMKCl100mMImidazole20mM2-ME10mMGlycerol10%9)用elutionbuffer洗脱三次,每次1mlElutionBuffer:Tris-HClpH8.520mMKCl100mMImidazole100mM2-ME10mMGlycerol10%6.用蛋白电泳，westernblotting,检验纯化的结构蛋白1)40ul蛋白溶液加入10ulSDS溶解液,沸水浴中煮2-5min2)蛋白电泳胶下层分离胶浓度为12%,上层浓缩胶浓度为5%浓度水30%AcerTris(pH8.8)10%SDSAP12%1.6ml2.0ml5%(3ml)1.72ml0.5ml3)电泳液为1XTris-GlypH8.3,起始电压为80V,进入分离胶后增加电压至120V,蛋白Marker为Bio-Rad生产的双色蛋白Marker.4)电泳结束后,将胶和滤纸,硝酸纤维素膜一起浸入转移buffer.5)电转仪电转蛋白从胶至硝酸纤维素膜上,六层滤纸加上硝酸纤维素膜,在加上胶,最后再加上六层滤纸,电流恒流0.20A,电压不超过25V,转膜0.5h.6)转膜后剪下MARKER,直接可以看到双色的条带,样品转的膜正面向下倒扣于3%脱脂奶粉-TBS溶液中封闭,37C0.5h.7)将兔抗hisX6抗体和兔抗Myc抗体稀释于3%脱脂奶粉-TBS溶液,每个样品50-100ul3%脱脂奶粉-TBS溶液,抗体稀释倍数为1:100,将膜正面向下扣于含有一抗的脱脂奶粉溶液中,37C1h或者4C过夜.8)将膜正面向上,加入TTBS,振荡洗涤10min,共三次.9)将带有碱性磷酸酶的抗兔IgG的羊多抗稀释到3%脱脂奶粉-TBS,每个样品50-100ul3%脱脂奶粉-TBS溶液,二抗的稀释倍数为1:200,将膜正面向下倒扣于含有二抗的奶粉中,37C1h.10)将膜正面向上,加入TTBS,振荡洗涤10min,共三次11)洗涤后,取一干净的培养皿,加入:APbuffer10mlBCIP33ulNBT66ul混匀后加入硝酸纤维素膜,显色2-3min.12)显出条带后,放入蒸馏水中洗去显色底物,中止显色反应,对照双色蛋白marker,确定获得的纯化蛋白的分子量大小,检验是否为所需要的sars结构蛋TEMED2ul3ul1．3ml(1.5M)0.76ml(0.5M)50ul30ul50ul30ul白.6.免疫荧光确定特定的结构蛋白在细胞内的定位1)SF9单层培养至(放有盖玻片)80%的密度后,加入100ul重组病毒培养上清,另外一个dish不加,作为对照.2)接毒48h-72h,吸取dish中的培养基,用1XPBS(pH7.4)洗三次,每次用1ml.3)吸走PBS后,加入4%多聚甲醛1ml室温固定10min.4)除去多聚甲醛后,用PBS洗两次.5)加入无水甲醇1ml,-20min2min.6)吸走一半体积甲醛,加入一半体积的PBS稀释甲醛,再吸走一半体积混合液,加入一半体积的PBS,重复5次.7)加入PBS洗3次,每次3-5min.8)将盖玻片正面向下倒扣于3%脱脂奶粉的PBS溶液中封闭,37C0.5h.9)将抗HisX6的一抗稀释于3%脱脂奶粉-PBS溶液,每个盖玻片50-100ul3%脱脂奶粉-PBS溶液,抗体稀释倍数为1:100,将盖玻片正面向下扣于含有一抗的脱脂奶粉溶液中,37C1h或者4C过夜.10)在dish中盖玻片正面向上用PBS洗6次,每次5min.11)将荧光标记的二抗用3%脱脂奶粉-PBS稀释,每个样品50-100ul3%脱脂奶粉-PBS溶液,二抗的稀释倍数为1:200,将盖玻片正面向下倒扣于含有二抗的奶粉中,37C1h.整个过程避光操作.12)在dish中盖玻片正面向上用PBS洗6次,每次5min,避光操作.13)取封闭液30ul(50%甘油,50%PBS)于干净的载玻片上,将盖玻片正面向下扣于封闭液中.如果需要加入其它的非活性染料,如染细胞核的DAPI染料,可以按比例加入封闭液中,等待10min左右.14)在荧光显微镜下观察细胞形态和荧光标记的结构蛋白在细胞中的分布.7.真核细胞中SARS-CoV结构蛋白的表达克隆到真核细胞表达载体上的结构蛋白,通过脂质体转染真核细胞,48h之后,可以通过免疫荧光或者westernblot检验表达出来的结构蛋白.8.带有荧光蛋白的重组蛋白在细胞内的定位将结构蛋白克隆到带有绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)的载体上,转染细胞后48小时,用PBS洗三次后,用4%的多聚甲醛固定10分钟,再用PBS洗三次,直接封片,在荧光显微镜下观察,确定结构蛋白在细胞中的定位.实验结果1.利用杆状病毒表达系统表达SARS的3个主要蛋白质：

M、N、S1)M、N、S-重组杆状病毒载体的PCR检测结果MarkerCMNS2)纯化的His-N和S-His的Westernblotting检测123图6M、N、S-重组杆状病毒载体的PCR检测结果未发生重组的杆状病毒用M13(+)/(-)引物只能扩增出300bp的条带，发生了重组的杆状病毒则能够扩增出目的片段大小+2.4K长度的条带，M、N、S基因分别长666、1269、3768bp,对应的PCR条带则为3.1,3.7,6.2Kbp.C为未发生重组的杆状病毒空对照.6.2K3.7K3.1K300bpHis-N,50KDa图7纯化的His-N的Westernblotting检测杆状病毒载体的N端带有6个His,经镍柱一步纯化后即可得到目标蛋白.1，2，3道分别为第1，2，3次洗脱液.12MarkerCSM2．真核表达的M、N、S的Westernblotting检测MarkerMyc-NMarkerHA-M-HisMarkerCS-His图10真核表达的M、N、S的Westernblotting检测Myc-N,HA-M-His分别用myc和HA抗体均检测到48KD,24KD的条带；Myc-N48KDaHA-M24KDaS-His~90KDa31K20K14K97K66K43K31K20KS-His150-250KDa250KD150KD100KD75KD50KD37KD25KD20KD图8纯化的S-His蛋白的westernblotting检测纯化的8管S蛋白中1,2管westernblotting出现条带,对照BIO-RAD双色蛋白Marker,说明目标蛋白S为150-250KD的蛋白(有糖基化)图9感染S-重组杆状病毒的SF9细胞加入1XSDS后煮沸10分钟,直接电泳,用westernblotting检验,对照为没有感染病毒的SF9细胞蛋白的westernblotting结果.出现了略大于150KD的条带S-His150KD250KD15010075503725S-His用His抗体检测出一条90Kda的特异条带和一条65KDa的非特异条带（C为空白的细胞对照，也有这条条带），90KDa的特异条带很可能是经过剪切和糖基化修饰的S蛋白，S蛋白全长应该为140KDa（不考虑糖基化）.3.用confocal观察的M、N重组荧光蛋白在细胞内的分布GFP-MRFP-NOverlap图11confocal观察M,N重组荧光蛋白在细胞内的分布情况绿色荧光蛋白代表M在细胞内的分布,主要分布在细胞质中;红色荧光蛋白代表N在细胞内的分布,也主要分布在细胞质中;重叠之后可以看到橙黄色部分为M,N共同分布的位置.GFP-S在Vero细胞中的分布4.S-N3(GFP-)在Vero细胞中的分布图12vero细胞脂质体转染S-N3(GFP为一个放大的细胞,可以看到S蛋白成膜泡状分布在细胞质中,部分细胞中膜泡围绕细胞核环状分布,对照组中没有任何荧光显示.-)48h之后进行做免疫荧光观察,左图为一群细胞,右图5．免疫荧光观察S蛋白在SF9细胞中的分布(Histag)蓝光激发的S蛋白免疫荧光图象S蛋白和细胞核的重叠图象明视场下看到的细胞图象紫外激发的细胞图象明视场图象和S蛋白,细胞核图象重叠明视场图象和细胞核图象重叠局部放大的重叠图象讨论一.实验中获得的蛋白经过检验与理论数值基本相符M、N、S基因分别长666,1269,3768bp,理论上翻译成蛋白质的分子量分别约为25KD,47KD,140KD,脂质体转染真核细胞得到的M、N、S蛋白经过westernblotting检验,大小分别为24KD,48KD,90KD,S蛋白的分子量远小于估计值,可能是由于真核细胞内存在不同的翻译体系,S蛋白由于内部的一些特殊氨基酸序列而被细胞内的某些酶选择性的剪切和修饰的结果.而在杆状病毒表达体系中获得的N和S蛋白westernblotting的结果显示,N、S的分子量分别为50KD和150KD.N蛋白与理论数值接近,S蛋白由于是一个跨膜糖蛋白,糖基化使分子量大于140KD.二.蛋白之间的相互关系N蛋白与病毒RNA相互作用形成核壳体,在某些冠状病毒中,核壳体会与M蛋白相互作用.SARS的GFP-M和RFP-N重组蛋白都分布在细胞质中,在部分区域出现共分布现象,但是这不足以说明M、N在SARS病毒中相互作用,需要进一步的免疫共沉淀试验来检验两者是否相互作用.如果M、N确实存在相互作用,可以突变M、N蛋白,制造缺失蛋白,看是否会影响两者之间的相互作用,从而确定两种蛋白相互作用的位点.进一步可以得到缺失了相互作用位点的突变病毒,作为安全有效的疫苗的一种选择.另外冠状病毒的S蛋白和M之间存在着相互作用,也可以按照研究M,N的相互作用,用两种重组的荧光蛋白同时转染细胞,观察共定位,免疫共沉淀确定是否存在相互作用,突变缺失确定作用位点,研究作用机制,为研制疫苗做准备.三.关于S蛋白的细胞内定位和继续研究的方向S蛋白在SARS病毒感染细胞中起着关键的作用,S蛋白是一个跨膜糖蛋白,N端在膜外,C端在膜内,N端有一段氨基酸作为信号肽指导S分泌出去,随后会被切除,因此S蛋白的tag6xHis设计在C端,所以tag始终都会在细胞质内,因此做免疫荧光时候必须用100%甲醇使细胞膜穿孔.观察到的结果说明在表达S的细胞中(包括脂质体转染S-表达载体和接毒S-重组杆状病毒),S蛋白都分布在细胞质图13一对SF9细胞的免疫荧光图象一抗为兔抗6XHis的多抗;二抗为抗兔IgG的羊多抗FITC(绿色),蓝光激发.对照没有任何荧光从S蛋白,细胞核的分布位置和明视场下细胞的位置的比较,可以发现,S蛋白分布在围绕细胞核的一圈细胞质内.中,集中在靠近核附近的一圈细胞质中,因此推测S蛋白是在靠近核膜附近的内质网上(或者外核膜)上的核糖体上合成,并储存在细胞质中,在没有其它结构蛋白(如M,N,E等蛋白)的情况下,因为不能组装成病毒粒子,从而不能分泌到细胞膜上,形成滞留在细胞质中的现象.在转染S-真核表达载体的Vero细胞中,免疫荧光观察到细胞质中的S蛋白围绕细胞核成环状颗粒分布,这可能是因为S蛋白无法形成病毒粒子分泌到体外而在细胞内过量积累,S蛋白之间相互作用,形成多聚体,在显微镜下观察到成团的发亮颗粒在细胞核周围的细胞质中.对S蛋白进行序列分析,发现整个蛋白中可能有一个globulardomain,表示可能为S1部分.穿膜区预测发现在1197-1218(氨基酸编号,前体肽的N端第一位氨基酸为1)有一段穿膜序列,位于此段序列N端的肽段为膜外片断,C端的为膜内片断,这里可能就是Sprotein和病毒外壳膜结合的位置.通过对二级结构的预测发现,在729-770,879-1016,1164-1185(图中的?表示位置不确定)分别有一个Helix区域,提示可能为S2中的Nhelix,Mhelix和Chelix,与病毒外壳膜和宿主细胞膜的融合有关.另外信号肽预测发现1-13可能为信号肽序列.由于表达S蛋白的细胞中缺乏M,N等其它结构蛋白,S蛋白只分布在细胞质中,无能分泌到细胞膜上,为了观察S能否介导细胞膜的融合,可以在细胞中转染其它结构蛋白-表达载体的质粒,并用SARS病愈患者血清中的人抗SARS多抗,在细胞不穿孔的情况下制作免疫荧光制片,如果出现荧光,说明S蛋白和其它蛋白相互作用而被运输到细胞膜上,可以进一步观察细胞膜上带有S蛋白的细胞可否与同种细胞融合.Fig14.SARS预测的S蛋白的模式图由于S蛋白在病毒感染中的关键作用,可以设计实验,使用药物作用于表达S蛋白的细胞,从中选择出对于抑止S蛋白有作用的药物作为控制SARS传播和治疗SARS的新型药物.四.SARS病毒与其它冠状病毒的关系冠状病毒属于正股单链RNA病毒家族,基因突变频率高,SARS病毒的蛋白和已知任何一种冠状病毒的相应蛋白同源性都比较低,不属于任何一个已知的类型,独立于成为一个分支,因此SARS病毒的许多性质都有可能与原有的冠状病毒不同,需要我们进一步的研究,比如SARS病毒的S蛋白的分布就可能与已知的冠状病毒不同,没有分泌到膜上,而是聚集在细胞质中的靠近核的周围的地区.同时我们也可以利用SARS的结构蛋白与其它冠状病毒的结构蛋白和RNA来获得重组病毒,选择其中对于人类没有感染力的重组病毒,运用于医学预防和治疗.图15Sars－COV的S、M、N蛋白与其他冠状病毒S、M、N蛋白的同源性的比较致谢在我完成这篇论文的时候,我已经进入实验室工作学习一年多了,在这段时间里,我的导师陈建国教授给予了我很多的指导和鼓励,帮助我顺利的完成实验.他在科研工作中所体现出来的丰富的想象力,敏锐的观察力,严谨的科学态度和对于生物科学的热爱,让我真实的体会到了科学的真正意义。

同时,我也要衷心的感谢实验室里的师兄师姐,在实验过程中,他们的耐心帮助和解答解决了我遇到的很多困难,帮助我掌握了很多的知识和技巧,让我感到了一个大家庭般的温暖。

最后,感谢政基金给我的这样一个宝贵的科研的机会,让我能够在本科二年级就开始进入实验室接触到最新最前沿的科学技术,开始真正的实验室工作,培养我的科学精神,训练我的实验技能,这一切都会让我在今后的成长道路上受益匪浅。

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