Survivin和COX-2在膀胱移行细胞癌中的表达

1/1Survivin和COX-2在膀胱移行细胞癌中的表达临床医学论文-Survivin和COX-2在膀胱移行细胞癌中的表达【摘要】目的探讨Survivin和COX-2在人膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其临床意义。

方法采用S-P免疫组化技术分别观察40例BTCC和10例正常膀胱组织标本中Survivin和COX-2的表达，分析其表达水平与BTCC临床病理参数之间的关系。

结果Survivin和COX-2基因在BTCC中的表达与在正常膀胱黏膜比较差异均有统计学意义(均为P＜0.01)。

不同临床分期和病理分级间Survivin和COX-2表达的差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

结论Survivin和COX-2的高表达是BTCC预后不良的指征，有望成为BTCC预后不良的独立性指标。

【关键词】移行膀胱癌；Survivin；COX-2Abstract:ObjectiveToexploretheexpressionofSurvivinandCOX-2inhumanbladdertransitionalcellcarcinoma(BTCC)andthebiologicalsignificance.MethodsImmunohistochemicalS-PmethodandRT-PCR、westernplotwasusedtodetecttheexpressionofSurvivinandCOX-2in40caseswithBTCCand10controlswithnormalbladdermucosa.ResultsTheexpressionoftheSurvivinandCOX-2inhumanBTCCwashigherthanthatinnormalbladdermucosa(P＜0.01).TherewassignificantdifferenceintheexpressionofSurvivinandCOX-2amongdifferentclinicalstages(P＜0.05).ThesignificantdifferenceintheexpressionofSurvivinandCOX-2amongthedifferentpathologicalgradeswasfound(P＜0.05orP＜0.01).ConclusionThehighexpressionofSurvivinandCOX-2couldberegardedasanindependentindicationforevaluatingtheprognosisinBTCC.Keywords:bladderneoplasms；survivin；COX-2膀胱移行细胞癌(BTCC)的浸润和转移进程复杂，与多种癌基因和抑癌基因的表达、调控以及细胞凋亡有关。

Survivin基因是近年来发现的凋亡抑制基因；COX-2基因是与抑制肿瘤转移相关的基因，它们对多种肿瘤的转移有调控作用。

本研究应用SP免疫组化方法和RT-PCR检测了40例膀胱癌和10例正常膀胱组织标本的Survivin和COX-2的表达，探讨其表达与BTCC临床分期、病理分级的相互关系，为临床正确估计预后和治疗提供依据。

1材料与方法1．1研究对象宁夏医学院附属医院泌尿外科2006年1月2006年12月电切和开放手术治疗的BTCC患者40例，其中男20例，女20例，年龄31～80岁，平均62岁。

经尿道膀胱肿瘤电切(TURBt)20例，膀胱部分切除10例，膀胱全切10例。

病理分级按WHO法，其中G1级15例，G2级15例，G3级10例；肿瘤分期按UICCTNM标准，其中T1期12例，T2期15例，T3期13例。

组织学分类：

40例均为BTCC。

从10例行开放手术的前列腺增生(BPH)患者取膀胱组织标本作对照。

1．2染色方法所有标本均经10%的多聚甲醛固定、石蜡包埋并进行连续超薄切片，分别作苏木精2伊红(HE)染色、免疫组织化学SP染色。

所有标本均由两位病理学专家确诊。

所有一抗均购自Maixin公司，SP试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供。

所有操作严格按试剂盒说明进行。

石蜡切片脱蜡，水化后行免疫组织化学染色。

抗体工作浓度Survivin为1∶100，COX-2为1∶200，最后用二氨基联苯氨(DAB)染色，苏木精复染。

以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，已知阳性标本作为阳性对照，阳性标本显色后，立即全部终止反应。

1.3结果判断Survivin、COX-2阳性表达为胞浆成棕黄色。

在切片阳性细胞区随机挑选10个高倍视野共计数1000个肿瘤细胞，按照文献［1］方法，在高倍镜下对染色作①如下评分：

染色深浅：

无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3②分；染色细胞计数：

没有细胞染色为0分，1%～10%为1分，11%～33%为2分，34%～66%为3分，＞66%为4分。

两项结果相加＜2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(6)，6～7分为强阳性(7)。

1.4RT-PCR检测Survivin、COX-2mRNA的表达分别收集培养的各组细胞，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，取1g总RNA反转录合成cDNA，再取20L反转录产物进行PCR循环。

Survivin引物序列：

上游5-ACAACCAAACCTCACACTACTG-3，下游5-ATAGATCCCATTACAGACAGCG-3。

COX-2引物序列：

上游5-GGATTTTTATTTAAGAGGAGTAGGT-3，下游5-CTACCAAAATTTTTATTATAATCCC-3。

Survivin产物长度439bp，COX-2产物长度468bp，94℃变性1min，60℃复性30s，72℃延伸40s，共35个循环，末次循环72℃延伸10min。

GAPDH引物序列：

上游5-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3，下游5-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3，产物长度648bp，94℃变性1min，55℃复性30s，72℃延伸40s，共30个循环，末次循环72℃延伸10min。

反应结束后取反应产物5L进行20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，UVP型凝胶图像分析系统做图，以各组目的基因与GAPDH基因灰度的比值代表Survivin、COX-2mRNA的表达量。

1.5数据分析各样本测定值以平均值标准差表示，以统计学软件SPSS11.0进行分析，采用Fisher确切概率法检验分析Survivin和COX-2在膀胱癌组及正常组织中表达的关系；采用RC列联表扩检验分析BTCC组织中survivin和COX-2的表达与其临床病理特征之间的关系；采用Pearosn相关性检验分析BTCC组织中Survivin和COX-2表达之间的相关性。

以a=0.05作为统计学检验的显著性水准。

2结果2.1BTCC及对照膀胱组织中Survivin、COX-2蛋白表达对照膀胱组织中Survivin、COX-2均无阳性表达，在BTCC中Survivin为胞浆和胞核成棕黄色(图1，见封4)，COX-2为细胞胞浆和胞膜染成棕黄色(图2，见封4)。

Survivin、COX-2在40例BTCC组织中阳性表达分别为29例(72.5%)、26例(65.0%)，在10例正常膀胱组织中为0例，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

在不同临床分期中Survivin、COX-2表达差异均有统计学意义(P＜0.05)；在不同病理分级中阳性表达差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，见表1。

表1Survivin、COX-2在BTCC中的表达（略）2.2Survivin、COX-2mRNA表达以各组目的基因与GAPDH基因灰度的比值代表SurvivinmRNA的表达量。

BTCC组织内Survivin、COX-2mRNA表达均显著增加，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2BTCC组织Survivin、COX-2表达量（略）3讨论Survivin是新近发现的一种细胞凋亡抑制蛋白，它具有抑制细胞凋亡与调节细胞周期两种功能，在大多数恶性肿瘤中都有表达，而在除胚胎期外的正常组织中不表达［2］。

Survivin可抑制Caspase级联反应下游的Caspase3、7，发挥其抗凋亡作用［3］，其用于BTCC的诊断已引起了广泛关注。

本研究发现，在40例BTCC中，Survivin的阳性表达率为72.5%，且与肿瘤的病理分级呈正相关，这与Gazzaniga等［4］研究结果一致。

COX-2是一种膜结合的分子量为71ku的糖蛋白，具有环氧合酶和过氧化物合成酶的双重功能［5］。

COX-2在正常组织中不表达或极微量表达，但在肿瘤组织中表达量显著提高，提示与肿瘤的发生密切相关。

COX-2参与肿瘤发生的机制不明，可能与促进肿瘤血管生成和抑制机体免疫反应等有关。

本研究发现，COX-2在BTCC组织中强阳性表达，并且与肿瘤的分级、分期相关。

提示COX-2的过表达不仅促进BTCC的发生，并且可能加强了肿瘤的侵袭和转移能力，本研究结果与Lim等［6］的发现相符。

Peng等［7］和Cornetta等［8］在对喉鳞癌和甲状腺癌的研究中也发现COX-2mRNA和COX-2蛋白呈高表达。

Gallo等［9］的研究表明，在头颈部肿瘤中COX-2的表达与肿瘤血管的生成有关，同时通过Cox多元回归分析发现，COX-2蛋白的过表达是最有意义的预后因子。

BTCC的转移复发是一个多步骤、多因素相互作用的复杂过程，单一的分子指标是无法进行精确预测的，各种指标中均无足够的特异性，采用多个指标进行联合检测是今后的研究方向。

在我们研究的2种基因中，其在染色体上的定位各不相同，Survivin为凋亡抑制蛋白，COX-2属原癌基因，2个基因在BTCC中表达增强，也说明膀胱肿瘤的发生是一个多基因突变的结果。

总之，COX-2和Survivin各自高表达或两者共同高表达均是BTCC预后不良的指征，有望成为BTCC预后不良的判断指标。

【参考文献】［1］FromowitzFB，VoilaMV，ChaoS，etal.Rasp21expressionintheprocressionofbreastcancer［J］.HumPathol，1987，18(8)：

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1117-1179.［4］GazzanigaP，GradiloneA，GiulianiL，etal.Expressionandprognosticsignificanceoflivin，survivinandotherapoptosis-relatedgenesintheprogressionofsuperficialbladdercancer［J］.AnnOncol，2003，14(3)：

85-88［5］XieWL，ChipmanJG，RobertsonDL，etal.Expressionofamitogen-responsivegeneencodingprostaglandinsynthaseisregulatedbymRNAsplicing［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1991，88(7)：

2692-2696.［6］LimSC，ParkSY，D