polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性

1/1polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性pol高表达与食管癌细胞耐药的相关性【关键词】DNA聚合酶；转染；食管肿瘤；肿瘤细胞，培养的；抗药性，肿瘤；四甲基偶氮唑蓝DNA聚合酶beta(polymerasebetagene，pol)广泛存在于哺乳动物细胞核内，是一条Mr为39103的单肽链小分子蛋白，由355个氨基酸组成，是目前已知的最小的DNA聚合酶.在碱基切除修复，DNA复制，跨损伤合成中发挥重要作用，还与基因组不稳定性有关［1-4］.近年来的研究表明在多种肿瘤组织及肿瘤细胞株内polmRNA的表达都明显增加［5-6］.pol与肿瘤细胞耐药性的关系也逐渐引起人们的注意.本实验通过研究人食管癌顺铂(concentrationofcisplatin,cDDP)耐药细胞系Ec9706/cDDP和稳定高表达人野生型pol的Ec9706细胞中pol的表达水平及其对抗肿瘤药cDDP的敏感性，旨在进一步探讨pol高表达与食管癌细胞耐药的相关性.1材料和方法1.1材料人食管癌细胞株Ec9706由中国医学科学院肿瘤研究所提供；cDDP山东齐鲁药业股份有限公司产品；RPMI1640培养液Gibco/BRL公司生产；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma产品；pEGFPC3(Clonetech公司)；野生型人pol重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFPAC3(微生物学与免疫学教研室赵国强教授惠赠)；G418(宝生物公司)；6TG(美国Sigma公司)；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；引物2对，由上海生工公司合成：

polRNA检测引物：

上游5TGTTTGCCAGCTTCCCAGTA3，下游5CTCCAGTGACTCCCAAGGGA3，扩增长度206bp；actin引物:上游5TCAAGATCATTGCTCCTCCTGA3，下游5CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG3，扩增长度113bp.1.2方法1.2.1cDDP诱导耐药细胞系Ec9706/cDDP的建立采用cDDP中等浓度、间歇作用方法建株.以终浓度为2mg/L的cDDP培养基冲击对数生长期的Ec9706细胞，48h后弃去含药培养基，PBS洗3次，换新鲜培养基.1～2d换液1次，洗去死亡细胞，待形成细胞克隆时传代，恢复稳定生长后提高cDDP浓度再次冲击，如此反复作用直至细胞可在浓度为0.5mg/L的cDDP培养液中维持培养.1.2.2稳定高表达人野生型pol的Ec9706细胞系的建立取对数生长期Ec9706细胞以2.5105个/孔接种于6孔板，待细胞融和度达60%～70%时，以正常Ec9706细胞作对照，分组转染pEGFPC3(空质粒)和pEGFPAC3，按转染试剂LipofectamineTM2000操作说明书进行.4～6h后，弃转染液换2mL含10mL/L胎牛血清的培养液继续培养.48h后以含750mg/LG418的培养液筛选，约14d后对照Ec9706细胞全部死亡，转染组改用含200mg/LG418的培养液，阳性克隆扩大培养后，建立稳定传代转染细胞系.转染pEGFPC3,pEGFPAC3的细胞分别用Ec9706C3,Ec9706AC3表示.1.2.3细胞形态学观察普通倒置显微镜下观察各组细胞形态，荧光显微镜观察转染后细胞绿色荧光.1.2.4RTPCR检测polmRNA的表达取细胞各1瓶，按Trizol试剂盒说明书抽提细胞总RNA，逆转录后PCR扩增.PCR反应体系30L：

10buffer3L，dNTP2.4L，上下游引物各0.5L，Taq酶0.5U，逆转录产物5L.PCR反应条件:94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，35个循环后，72℃延伸5min.15g/L琼脂糖凝胶电泳.SYNGENE凝胶分析系统软件分析电泳结果，用pol与actin积分吸光度值的比值表示pol基因的相对表达水平.1.2.5MTT法测细胞对cDDP敏感性的变化常规MTT法检测，酶标仪以波长550nm测各孔A值，计算相对抑制率（％）＝（1-加药孔A值/对照孔A值）100％，用IC50计算器软件计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度(IC50)，耐药指数(RI)=待测细胞IC50/Ec9706细胞IC50.统计学处理：

用SPSS10.0统计软件处理数据，数据以xs表示，t检验，=0.05.2结果2.1各组细胞形态经过9mo的体外诱导筛选获得了在含0.5mg/L的cDDP培养液中生长良好的耐药细胞系Ec9706/cDDP.诱导过程中在加入cDDP后24h倒置显微镜下可见大部分细胞因死亡而漂浮起来，培养液略浑浊，残留贴壁细胞发生明显改变，大小不均匀，有巨细胞产生，形态不规则，细胞突起及部分细胞质中黑色颗粒较多，生长缓慢，于20d左右可形成细胞克隆，传代后逐渐接近原来细胞形状（图1）.此外，倒置显微镜下观察转染前后细胞形态无明显差异，均呈多角形或圆形；在荧光显微镜488nm波长下Ec9706AC3与Ec9706C3细胞呈现绿色荧光，而对照Ec9706细胞则无荧光.2.2RTPCR结果耐药细胞Ec9706/cDDP与亲本细胞RTPCR后电泳结果见图2.经灰度扫描后两种细胞内polmRNA与actin相比其相对表达水平分别为0.490.09，0.810.16，Ec9706/cDDP中pol的表达高于亲本细胞（Plt;0.05），是亲本细胞的1.65倍；转染细胞RTPCR后电泳结果见图3.经灰度扫描后Ec9706，Ec9706C3及Ec9706AC3细胞内polmRNA与actin相比，其相对表达水平分别为0.520.13，0.480.11，1.210.15，表明Ec9706AC3细胞内pol的表达高于Ec9706及Ec9706C3细胞（Plt;0.05），是Ec9706细胞的2.33倍；而Ec9706C3细胞内pol的表达与Ec9706细胞相比较差异无统计学意义（Pgt;0.05）.A:正常不加药的Ec9706细胞；B:加药后24h细胞；C:加药后20d左右形成的克隆；D:Ec9706/cDDP细胞.2.3各组细胞对cDDP的敏感性经MTT法检测，人食管癌cDDP耐药细胞系Ec9706/cDDP的耐药指数为15.70.而Ec9706AC3对cDDP的耐药指数为1.78，与Ec9706相比对cDDP的敏感性显著降低（Plt;0.05），而对照转染空质粒的Ec9706C3的IC50是Ec9706的0.97倍，与Ec9706相比对cDDP的敏感性无明显改变（Pgt;0.05）.3讨论肿瘤细胞的耐药机制有多种，包括药物的蓄积降低、细胞解毒功能的增强、药物靶蛋白（如拓扑异构酶TPO）量或活性的改变等.通常MRP,mdr1,GST,TPO与二氢叶酸还原酶等基因的异常表达与肿瘤的耐药关系密切［7-8］.近年来，DNA修复能力增强（如pol表达增强）与耐药性的关系也逐渐引起人们的注意.pol于1971年由Weissbach等［9］在牛胸腺细胞中发现，通常情况下在体内恒定低水平表达，主要参与DNA修复，在碱基切除修复（baseexcisionrepair,BER）的过程中填补单核苷酸缺口，碱基掺入过程有很高的错误率，体外DNA聚合反应中单碱基错误掺入率为1/1000～1/6600，是哺乳动物体内复制保真度最低、最不精确的一种DNA聚合酶［10-11］.细胞为了正常分化以及DNA的正常复制与修复，pol在细胞内的表达水平必须维持到一个适量的稳定水平.当pol高表达时，可导致细胞自身突变率增加、遗传不稳定性的发生以及对一些抗癌药物产生耐受.有学者报导，将表达pol的质粒转染如中国仓鼠卵巢细胞中发现转染细胞对cDDP等化疗药物的敏感性降低［3］.对cDDP耐药的卵巢癌细胞株中pol的表达比亲本细胞增加了8倍［12］.本研究诱导建立了人食管癌cDDP耐药细胞系Ec9706/cDDP，该细胞耐药指数达15.70，细胞内pol表达是亲本食管癌细胞Ec9706的1.65倍；同时采用脂质体转染法将人野生型pol重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFPAC3导入食管癌细胞Ec9706后，其pol表达是Ec9706细胞的2.33倍，对cDDP的敏感性降低，耐药指数为1.78.这些均表明pol的高表达与肿瘤细胞对cDDP等的耐药有关，pol的高表达可引起耐药性的产生，耐药细胞中pol的表达也会增高.同时，研究发现转染有pol表达载体的Ec9706AC3细胞内pol的表达高于耐药细胞Ec9706/cDDP，而其耐药指数却低于Ec9706/cDDP细胞，说明体外诱导产生的耐药细胞Ec9706/cDDP的耐药机制有除pol外其它机制的参与.【参考文献】［1］IdrissHT,AlAssarO,WilsonSH.DNApolymerasebeta［J］.IntJBiochemCellBiol,2002,34(4):321-324.［2］CanitrotY,FrechetM,ServantL,etal.OverexpressionofDNApolymerasebeta:Agenomicinstabilityenhancerprocess［J］.FASEBJ,1999,13(9):1107-1111.［3］CanitrotY,CazauxC,FrechetM,etal.OverexpressionofDNApolymerasebetaincellresultsinamutatorphenotypeandadecreasedsensitivitytoanticancerdrugs［J］.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(21):12586-12590.［4］赵继敏,金戈,黄幼田,等.不同类型的DNA聚合酶基因对CHO细胞的影响［J］.第四军医大学学报,2005,26(19):1805-1807.［5］SrivastavaDK,HusainI,ArteagaC,etal.DNApolymerasebetaexpressiondifferencesinselectedhumantumorsandcelllines［J］.Carcinogenesis,1999,20(6):1049-1054.［6］董子明,赵国强,赵勤,等.人食管癌中pol基因突变的研究［J］.中华医学杂志,2002,82(13):899-902.［7］AkiyamaS.Mechanismsofdrugresistanceandreversaloftheresistance［J］.HumCell,2001,14(4):257-260.［8］GottesmanMM.Mechanismsofcancerdrugresistance［J］.AnnuRevMed,2002,53:615-627.［9］WeissbachA,SchlabachA,FridlenderB,etal.DNApolymerasesfromhumancells［J］.