DNA甲基化与先天性心脏病的研究进展

1/1DNA甲基化与先天性心脏病的研究进展1检测DNA甲基化在研究先天性心脏病发病机制的评价刘婷2（综述）严文华3（审校）【摘要】DNA甲基化（DNAmethylation）是目前研究先天性心脏病发病机制的热点。

某些基因的异常甲基化可引起相关的心脏畸形及综合症。

随着DNA甲基化检测水平的提高，DNA甲基化的检测可为先天性心脏病的早期临床诊治提供理论依据。

【关键词】先天性心脏病，DNA甲基化，表观遗传学，直接测序法EvalutionofthedetectionofDNAmethylationinthepathogenesisofcongentialheartdiseaseLIUTing，YANWen-hua.DepartmentofPaediatrics,SoochowUniversityAffiliatedChildren’sHospital,Suzhou215005,China.【Abstract】DNAmethylationisthecongenitalheartdiseasepathogenesisresearchhotspot.Abnormalmethylationofcertaingenescancauseheartmalformationsandsyndromes.WiththeraiseofthelevelofdetectionofDNAmethylation,DNAmethylationdetectiontoprovideatheoreticalbasisfortheearlydiagnosisandtreatmentofcongenitalheartdisease.【Keywords】Congenitalheartdisease,DNAmethylation,Epigenetics,Directsequencing先天性心脏病（congentialheartdisease,CHD）是新生儿出生缺陷最常见的疾病之一，是由胎儿期心脏、大血管发育异常而导致的心血管在形态、结构、功能及代谢上的异常。

在全世界范围内，活产婴儿中CHD的发生率为0.4%至5%，在流产或死胎的胎儿中发生率更高6～9。

多年研究已经证实，先天性心脏病是由遗传因素和环境因素相互作用而引起的多基因异常的疾病,其中遗传因素是主要因素。

经典遗传学认为，DNA遗传信息受损如：

序列突变、缺损、插入，等缺陷将导致先心病的发生，而近年来，随着现代遗传学和生物信息学的发展，对先心病发病机制的认识进入了一个新的层次：

现代遗传学认为，除DNA序列包含遗传信息外，DNA、组蛋白或是染色体水平的修饰水平及方式，也可在在发育和细胞增殖过程中稳定遗传，并且修饰水平异常可通过影响心脏发育的重要基因表达，进而导致先天性心脏病的发生。

如：

DNA甲基化、乙酰化、组蛋白修饰等。

其中，DNA甲基化是哺乳动物基因组发生的最为常见的一种表观遗传学事件，因此，研究DNA的甲基化与先天性心脏病的关系，成为当前临床医学的关注热点，本文就DNA甲基化与先天性心脏病的发病关系进行综述。

一、DNA甲基化的定义及分子基础1.1、定义及机制DNA甲基化(DNAmethylation)是表观遗传学研究最深入的一种机制，它是一种酶介导的化学修饰过程，通过将S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，并在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的催化下，CpG二核苷酸中的胞［1］，在我国活产新生儿中CHD的发生率为1工作单位:苏州大学附属儿童医院心内科邮编2150052在读研究生3通讯作者嘧啶环上的5位置的氢被活性甲基所取代，从而转变成5-甲基胞嘧啶（5mC，5-methylcytosine）。

这种修饰通常发生在未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌(cytosine-phosphateguanosine,CpG)位点的胞嘧啶上。

研究表明，基因组上调控启动子区域中有某些区域CpG位点高度聚集，其序列的长度大于200个碱基，这些区域被命名为CpG岛。

启动子区域CpG岛的甲基化水平可调控下游靶基因的表达。

通常大部分基因，生理情况下启动子区域CpG岛多以非甲基化形式存在,使基因能够正常表达。

当其发生甲基化时,可影响基因的转录调控,抑制基因表达,导致许多细胞信号通路的阻断，包括DNA复制、细胞周期调控等。

DNA甲基化形式是在胚胎期器官发育过程中的特定时期建立的。

除印记基因外，基因组DNA在受精完成后，经历广泛的脱甲基化，并在受精卵种植阶段经历DNA的从头甲基化，从而使生后及成年期各器官、组织基因组DNA是呈现器官特异性的甲基化形式。

当基因组DNA的甲基化模式在胎儿发育时期发生紊乱，可导致基因的异常表达，影响心脏及血管的发育，进而导致先天性心脏病的发生。

1.2.DNA甲基化的影响因素这种DNA修饰方式并没有改变基因序列,但它明确调控了基因的表达。

影响DNA甲基化的因素主要是组蛋白甲基化、DNMT（DNA甲基转移酶）、RNA干扰、饮食等。

二、DNA甲基化与先天性心脏病关系的研究先天性心脏病的病因目前还不能完全被阐明,但多数学者认为,除了少数先天性心脏病是单基因突变和染色体畸变引起的,大多数先天性心脏病属于多基因遗传病,是由遗传因素和环境因素相互作用引起的，心脏发育是一系列基因、转录因子在时间、空间上高度协调配合而共同完成的，其发育过程中的某些关键基因启动子区域甲基化的异常改变，将影响心脏的发育，因此，寻找DNA甲基化的靶基因，将有助于了解先天性心脏病的发病机制，为进一步干预提供有用的分子靶标。

目前与先心病发生相关的甲基化基因研究叙述如下：

2.1T-box转录因子家族该基因家族存在一个高度保守序列，即18－aa特异性DNA末端结合区域，称为T－box。

T－box家族分为5个不同的亚家族，在脊椎动物心脏中表达的主要有TBX1和TBX2亚家族，其中与心脏发育相关的基因主要是TBX1亚家族的TBX1、TBX18、TBX20及TBX2亚家族中的TBX2、TBX3、TBX5人类TBX1基因定位于22q11.2，参与胚胎心脏发育，在心月牙、原始心肌和原始次级心区中表达，参与流出道心肌细胞增殖。

TBX1基因突变可导致DiGeorge综合征的发生，该病累及多个器官，心脏畸形主要为心脏神经嵴迁移异常所致，包括：

主动脉离断、永存动脉干（Persistenttruncusarteriosus，PTA）、法洛四联症（TetralogyofFallot，TOF）、右室双出口和大动脉换位基因敲除小鼠表现为类似DiGeorge综合征的咽弓及心脏畸形。

人ASH2L基因是果蝇ash2的同源基因,ASH2L所在的复合体具有H3-K4甲基化酶活性。

JasonZStollerTBX1转录因子的转录调控，进而影响心脏的发育。

TBX5基因定位于12q24.1，DNA全长2133bp，含有8个外显子，编码518个氨基酸。

Hateher[5]等对胚胎和成人心脏TBX5的表达情况的研究表明，TBX5在4个心腔的心外膜和心肌细胞核中表达，且还在左心室的心内膜层表达。

TBX5已被［2］。

［3］。

TBX1［4］等研究证实，Ash2l(含组蛋白甲基化转移酶(HMT)复合物)参与依赖于确认为HoltOmm综合征(HOS)的致病基因。

HOS-又称心手综合征，属常染色体显性遗传病，患者表现为以房间隔缺损(ASD)为主的心脏异常及上肢不同部位、不同程度的畸形。

BassonCTASD多见，也可并存多种畸形如大血管错位、TOF等复杂畸型。

近年来有关TBX5与表观遗传调控之间的关联研究表明，TBX5通过结合增强子，与其他心脏特异转录信号和染色体修饰酶例如HATs，调节关键基因表达色谱(DHPLC)技术和甲基化敏感性限制性内切酶法分析单纯性CHD患者TBX5基因启动子区域的突变及甲基化情况，结果表明TBX5基因启动子区域的突变、甲基化可能不是引起TBX5基因表达下调的原因，由于样本量有限，故可能未检测到有意义的突变，有待于扩大样本进一步研究。

2.2CHD7人类CHD7基因位于染色体8q12．1，编码一个含有2997个氨基酸的蛋白质。

VissersCHARGE综合征患者常合并CHD，其中最常见的是法洛氏四联症(约占33％)。

CHD7属于ATP依赖性染色体重构蛋白，该种蛋白调控DNA包装蛋白的运动以影响特定基因的可及性，而基因的可及性可控制细胞的命运。

Wysocka实验室利用爪蟾胚胎研究发现，抑制CHD7表达或其活性会影响神经脊细胞的迁移能力，产生的蝌蚪表现出类人CHARGE综合症的畸形。

神经脊细胞在发育早期一部分折叠成一个将来发育成脊髓和大脑的管状结构。

神经脊细胞在神经管接缝处形成，并快速迁移到身体各个部位，形成心脏组织、外周神经系统及身体其它部分。

Schnetz不连续区域，对每一种细胞类型来说都具有特异性，CHD7的细胞特异性结合区与一组甲基化组蛋白H3赖氨酸4(H3K4me)有关联。

Vermeulen组蛋白H3赖氨酸4(H3K4me3)是一种在活跃基因上发现的特殊甲基化标志，它为基础转录因子TFIID提供了一个结合位点，从而支持转录激活，组蛋白H3赖氨酸4发生甲基化可以改变基因转录，导致基因突变。

2.3LINE1该基因是哺乳动物基因组广泛分布的散布性长核酸元件(longinterspersednucleotideacidselement-1,L1)，已发现L1与多种生物学现象有关联，包括基因突变，X染色体失活，等位基因排斥，基因组重排，基因表达沉默，肿瘤发生，生物进化等。

L1基因全长5～7kb,反转座子长约6kb，5端为约910bp的非翻译区(5UTR),其后为两个蛋白的编码区(ORF1和ORF2)，两ORF之间为63bp的连接区，3端为约205bp的非翻译区(3UTR)，末端是长度多变的多聚A尾。

L1甲基化状态的改变已在结肠癌、神经管缺陷和系统性红斑狼疮等疾病中广泛发生且被证实。

WeiSheng风险。

ShimulChowdhury此，LINE-1可能作为早期诊断，判断胎儿TOF发生可能性。

2.4JAG1基因该基因编码Notch家族受体配体蛋白jagged1蛋白，该基因在人类胚胎发育中起着重要作用，且主要在心血管系统表达，突变率较高，目前已发现有200余种突变存在。

该基因突变在大多数Alagille综合征（AGS）中被发现，被证实是AGS致病基因，其中90%以上常合并心血管异常，大多数表现为肺动脉狭窄、法洛四联症等右心发育缺陷。

族性法洛四联症。

国内研究发现Notch1及其配体JAG1基因低甲基化在肿瘤发生发展中起重要作用，但该基因启动子发生甲基化与先心病是否相关仍有待于进一步研究。

［6］等研究发现TBX5突变可导致严重的心脏畸形，以［7］。

国内采用高效液相［8］等首次证实该基因是CHARGE综合征的易感基因。

［9］等研究指出CHD7基因突变可引起心肌缺陷。

CHD7定位于染色体的［10］等发现甲基化［11］等证实LINE-1低甲基化水平会增加发生TOF［12］等证实产妇LINE-1DNA甲基化与CHDs相关，因［13］有报道JAG1基因突变引起家2.5NKX2-5该基因定位于染色体5a35，含2个外显子，编码324个氨基酸，是同源盒基因家族中的重要成员,它主要通过同源结构域(homodomain,HD)与目的基因中相应的顺式作用元件结合，作为转录因子启动下游基因的转录，在胚胎发育和器官形成过程中发挥重要作用。

NKX2-5是心脏特异性转录因子，高度保守，是脊椎动物心脏育生中较早表达的转录因子，是心脏祖细胞最早的标志物，贯穿心脏发育的整个过程。

NKX2-5自胚胎发育第7.5天开始持续表达,其正常表达对心脏的环化、心房及心室发育、动脉干分隔、房室瓣形成及房室传导的维持均起重要作用。

NKX2-5基因敲除小鼠表现为环化后的心脏发育停滞、血管发育异常，并在心脏完全环化前死亡。

因此，可表明NKX2-5对于哺乳动物心脏的正常发育十分关键[14]。

临床研究显示，NKX2-5基因在法洛四联症和房间隔缺损患者中有4%突变率。

近年来，从表观遗传学角度探讨，该基因在先心病中的作用机制，成为热点。

马端性圆锥干下畸形发病密切相关。

NKX2-5可能通过调节Jarid2(Jarid2/Jmj)表达参与组蛋白去甲基化和甲基化的表观遗传调控2.65，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(methylenetrahydrofolatereductase,MTHFR)位于染色体1p36.3,编码区整个长度为1980bp,其cDNA序列长度为2200bp。

MTHFR基因由11个外显子组成,长度为102～432bp不等,编码具有活性的蛋白相对分子质量约为70000。

MTHFR是甲硫氨酸-叶酸代谢途径中的关键酶,可将体内的5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，为体内叶酸主要活性形式。

5-甲基四氢叶酸一方面作为细胞内一碳单位的载体，参与嘌呤和嘧啶的合成，并为DNA、RNA和蛋白质的甲基化提供甲基，从而影响DNA的合成和修复；另一方面作为甲基供体，在甲硫氨酸合酶催化下，以维生素B12为辅酶，使血中同型半胱氨酸发生再甲基化，生成甲硫氨酸，从而维持血中同型半胱氨酸正常水平活性能够保持循环叶酸和甲硫氨酸池的有效性，保证DNA合成和甲基化的正常进行。

MTHFR基因突变可使酶活性降低，则导致5-甲基四氢叶酸生成障碍，血浆同型半胱氨酸水平高，引起DNA合成和甲基化异常，从而导致包括心血管疾病、巨幼细胞性贫血、高同型半胱氨酸血症及胚胎发育异常等多种疾病的发生，特别是神经管缺陷和CHD许多研究证实MTHFR基因的多态性与先天性动脉导管未闭、房间隔缺损的发生密切相关。

张文迪基因启动子甲基化水平与先心病的关联，表明该基因启动子区域发生超甲基化可导致先心病。

2.7GATA-4该基因位于染色体8p23．1～p22．包括7个外显子，编码442个氨基酸，分子质量为44627u。

该基因是与心脏发育密切相关的一种特定细胞核转录因子，属于锌指蛋白转录因子，含有DNA结合域和转录激活域。

DNA结合区由两个位于羧基末端的锌指结构和邻近C末端碱性氨基酸富集区组成。

在中胚层和内胚层起源的组织中广泛表达，通过与其他转录因子如，血浆应答因子（SRF）、NKX2.5等相互作用，调控心肌中特异的基因表达。

Garg[19]等研究表明，该基因突变可导致先心病-室间隔缺损的发生。

ZeisbergGATA4可调节心肌的增值，并且对右心室和房室管的发育具有特殊的阶段效应。

GATA4表达减少，将导致ASD、VSD、TOF等各种先心病。

GATA-5是心脏原基胚胎中线的迁移和内胚层的形态所需的。

GATA-5的过度表达引起包括心肌基因NKX2-5和产生病灶的搏动心肌组织异常的表达。

在斑［15］等研究表明NKX2-5基因启动子甲基化可能与先天［7］。

［16］。

正常的MTHFR［17］。

［18］等采取MSP（甲基化特异性PCR）方法研究MTHFR［20］等研究发现，心肌的马鱼模式动物研究中表明GATA-5控制斑马鱼生长、形态发生和心脏及内胚层的分化，并指出GATA-5调节心肌早期基因NKX2-5的表达基因小鼠实验中证实，GATA-4和GATA-5表达减少可致心室壁变薄。

GATA-5第二等位基因的缺失可导致房间隔缺损，室间隔缺损，心内膜垫缺损等心脏畸形。

因此，辛格等得出：

GATA-4和GATA-5在心脏发育中起关键角色，但GATA-5在这个过程中确切机制，需进一步研究。

Akiyama,Y动子发生了甲基化。

GATA-5启动子甲基化和过度表达，在胰腺癌中有报道。

同时GATA4/5在胃低度上皮内瘤变和不典型增生中研究发现成高频率的甲基化状态化水平与先心病相关性未见有报道，仍需进一步探讨。

2.8NOX5基因属于NADPH氧化酶家族一员，该家族有七个成员，目前从血管及内皮分离出的有NOX1、2、4、5，其中NOX5发现时间短，研究较少，已有研究显示该基因主要调节细胞增殖、细胞因子生成等。

国内研究NOX基因在缺血性心肌病患儿中表达上调。

CHUNZHU平与先天性心脏病相关性，证实该基因在室间隔缺损患儿中CPG岛呈超甲基化水平（先心患儿甲基化水平为66.67%，而正常儿童中为20%）。

2.9PLAGL1基因抑癌基因PLAGL1定位于人染色体6p24-25，编码一种含有锌脂机构的核转录因子。

PLAGL1具有广泛的抗细胞增殖、诱导细胞凋亡及抑制肿瘤生长的功能。

国内外研究均表明该基因表达下降与胃癌、乳腺癌、骨肉瘤等发生密切相关。

ChaoXuan蛋白质编码的外显子2发生了同义突变，也许单纯VSD发病机制与这种突变无直接关联，可能与PLAGL1基因表达其他调控模式相关比如甲基化依赖模式。

三、DNA甲基化检测方法新进展随着DNA甲基化与诸多疾病相关性的深入研究，各种甲基化检测方法被相继开发。

目前临床上进行大规模分析多重CpG岛的方法包括:限制性标记基因组扫描、特定的甲基化杂交、DNA微阵列法等，但在处理样本时尚存在一些实际问题，如由于在甲基化和非甲基化等位基因中杂交效率的不同而降低了探针的分辨能力，且这些检测方法有损于先进的芯片学和生物信息学技术，使其应用受到限制。

以下是常用的甲基化检测方法。

3.1直接测序法用重亚硫酸盐处理DNA，使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,然后用不含任何CpG位点的引物进行PCR扩增，以扩增时区分甲基化或非甲基化。

扩增后尿嘧啶全部转为胸腺嘧啶，对PCR产物进行测序，且与未处理的序列比较，根据缺失条带判断CpG位点是否发生甲基化。

该方法可靠性和精确性均较高，且能明确目的片段中每一个位点的甲基化状态。

缺点是需要大量的克隆测序，操作过程繁杂，费用较高。

3.2MSP(甲基化特异性的PCR法)先将DNA用重亚硫酸盐处理,随后进行引物特异性的PCR。

该方法核心是设计引物，设计出的特异性引物与含有一个或多个CpG位点的待测序列结合，根据待测序列是否发生甲基化，则用相应的引物扩增出片段。

该法的优点是:快速敏感性高,可用于超微量及同源分析,特异性接近100%,而且可用于石蜡包埋［21］。

辛格[22]等在转［23］等研究表明GATA-4，5在结直肠癌（CRC）和胃癌中发生启［24］的超甲基化现象在人类肿瘤中普遍存在，GATA-4［25］。

GATA4/5启动子甲基［26］等研究该基因启动子甲基化水［27］等通过病例对照研究，发现在中国单纯VSD病人中PLAGL1样品的检测分析。

缺点是引物设计要求高，可靠的MSP引物设计需包含两个或多个完全甲基化或非甲基化的CpG位点，只能做定性研究,不能作为定量检测存在。

存在重亚硫酸处理不完全导致的假阳性问题。

3.3结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfaterestrictionanylysis,COBRA)，该方法是先后对样本DNA进行重亚硫酸盐处理、PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留,而非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶。

然后利用限制性内切酶BstUI（CGCG）对PCR产物进行切割,来识别DNA甲基化的状况。

该方法的优点:不需要预先知道CpG位点及样本序列;可进行甲基化水平定量研究;所需样本量少,可用于石蜡包埋样本的分析。

缺点：

只能获得特殊酶切位点甲基化的情况,检测阴性不能排除样本存在DNA甲基化的可能，由于限制性内切酶和PCR的使用，序列分析受到限制。

3.4甲基化敏感性斑点分析(methylation-sensitivedotblotassay,MS-DBA)，该方法是先用重亚硫酸盐处理标本DNA片段,而后以非CG区的引物进行PCR扩增，将扩增产物转移到尼龙膜上,用3端DIG标记的含有2个CG或TG的双核苷酸探针与DNA杂交,然后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应,通过比较斑点上荧光的强度进行甲基化水平的定量。

该方法能够定量或半定量分析样本甲基化水平，简便易行,能检测多种样本。

但检测序列不能过长，若重亚硫酸盐处理不完全或探针错误杂交,则可能出现假阳性或假阴性的结果3.5甲基化特异性多连接依赖性探针扩增(Methylation-Specificmultiplexligation-dependentprobeamplification，MS-MLPA)法，用MS-MLPA探针与标本DNA进行杂交形成DNA-探针复合物,然后加入连接酶及甲基化敏感的限制性内切酶,如果DNA中被识别的CpG位点存在甲基化,则探针顺利连接,PCR照常进行;若为非甲基化,则两个寡核苷酸链不能连接,复合物将消化而不能扩增。

其优点是所需的样本数量少,可分析大量的混合样本，可用于定量检测。

缺点是探针连接位点受限制性内切酶识别位点的限制,还要考虑所用酶的适宜反应温度。

综上所述,DNA甲基化在人类先心病发病机制究中起重要作用。

探讨其发病机制，可以为从事该项目研究的科研人员提供有价值的参考以及为先心病的早期临床诊治提供理论依据。

随着DNA甲基化检测技术的提高,先心病的甲基化检测将得到有力的技术支持。

但是由于样本量有限，以及无法准确获得心肌组织等诸多外因，无法明确外周血甲基化情况可否真实反映心肌组织甲基化水平。

同时先心病的是多因素相互作用的复杂疾病（包括环境因素，母体因素等），甲基化靶基因存在时空表达差异，故就增加了先心病诊断和治疗的复杂性，故DNA甲基化在揭示先心病发病机制的价值需进一步探讨。

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