CDR3导向抗体库法人源化抗膀胱癌Fab的鉴定

1/1CDR3导向抗体库法人源化抗膀胱癌Fab的鉴定CDR3导向抗体库法人源化抗膀胱癌Fab的鉴定【摘要】目的:对通过CDR3导向抗体库法筛选到的3株人源化膀胱癌噬菌体抗体进行进一步分析鉴定。

方法:用ELISA方法对筛选特异性克隆进行特异性鉴定、抗原表位的核实;采用硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力;选用活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验。

结果:3株阳性克隆可溶性表达后能够与膀胱癌EJ细胞特异性结合;与鼠源噬菌体抗体(BDI)相比,2株克隆的亲和指数比较低,均为0.25mol/L,1株克隆的亲和指数为0.7mol/L,略低于鼠源的亲和指数（0.9mol/L）的水平。

选择活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验,显示该克隆能够与癌组织特异性结合。

结论:用CDR3导向库法获得的人源抗体片段基本保持了原鼠源单克隆抗体(mAb)BDI的特性。

【关键词】抗膀胱癌单克隆抗体噬菌体抗体库鼠单克隆抗体人源化单克隆抗体(mAb)在许多领域得到极为广泛的应用,但由于其鼠源性,限制了在临床治疗方面的应用,近几年由于人源化和人源抗体研制技术的进展才得以迅速发展。

目前,对鼠mAb进行人源化改造有多种方案。

以噬菌体抗体库技术为基础的抗原表位定向选择法是近年来发展起来的一种鼠mAb人源化新方法［1,2］。

该方法通过鼠-人轻重链可变区杂合配对,用抗原进行亲和筛选,最终得到与亲本鼠mAb识别相同抗原表位的人源抗体。

该方法能够确保所筛选到的抗体为人源抗体,不含鼠源序列。

但所获人源mAb的特异性及亲和力难以得到保证,有时所获人源抗体与抗原的结合活性会产生漂移,与亲本鼠mAb有所不同。

CDR3导向抗体库法是在抗原表位定向选择法的基础上尝试的一种新方法。

该方法通过构建含鼠mAbCDR3区基因的人源抗体库,并利用cre-loxp定位重组系统构建大容量抗体库,直接筛选与亲本鼠mAb特异性相同的人源抗体。

运用该方法我们尝试人源化抗膀胱癌鼠mAbBDI,获得3株人源噬菌体抗体Fab基因,并证实筛选到的克隆与亲本鼠mAb识别相同的抗原表位［3］。

本研究中,我们将对其特性作进一步分析鉴定。

1材料和方法1.1材料抗膀胱癌噬菌体抗体由本室运用CDR3导向抗体库法筛选获得,抗膀胱癌人-鼠嵌合抗体（cBDI）、抗乙肝表面抗原Fab(HBsAgFab)、大肠杆菌菌株、VCSM13、L929细胞由本室制备保存［4］;抗膀胱癌鼠mAb(BDI)、膀胱癌细胞株（EJ）由北京大学医学部泌尿研究所俞莉章教授提供;限制性内切酶为TaKaRa公司产品;各种酶标抗体购自Promega公司和Sigma公司。

1.2方法1.2.1可溶性Fab抗体的表达及检测参照文献［5］介绍的方法构建和表达可溶性Fab抗体,并按照文献［6］介绍的方法接种膀胱癌EJ细胞及L929细胞于96孔板,以HRP-羊抗人Fab为二抗,检测上清中人Fab与膀胱癌细胞的结合活性及特异性。

1.2.2相对亲和力的测定（1）测定硫氰酸铵(NH4SCN)对EJ细胞抗原的影响:接种EJ细胞于96孔板培养过夜,用2.5mL/L戊二醛或丙酮/无水乙醇（1∶1）固定细胞,30g/L的脱脂牛奶-PBS（MPBS）37℃封闭1h,加入不同浓度（0～2.0mol/L）的NH4SCN,室温静置15min,PBS洗3次,加入相同浓度的鼠mAb(BDI)和嵌合抗体（cBDI）,50L/孔,37℃孵育1h,0.5mL/LTween-20/PBS洗3次,加入HRP-羊抗鼠或HRP-羊抗人Fab(1∶2000),37℃孵育1h,再经洗涤后OPD显色。

（2）用NH4SCN洗脱法测定相对亲和力:种植于96孔板的EJ细胞经固定及封闭后,加入待测抗膀胱癌mAbFab噬菌体上清50L/孔,37℃孵育1h,0.5mL/LTween-20/PBS洗3次,加50L/孔不同浓度的NH4SCN,室温静置15min,PBS洗3次,加入HRP-抗M13（1∶5000）37℃孵育2h,再经洗涤后OPD显色,A490计数。

抗体与抗原结合的A490值在经洗脱后下降至50%的NH4SCN浓度即为该抗体的亲和指数,以mol/L表示［7］。

1.2.3免疫组化实验取临床病理确定的膀胱癌标本的石蜡切片脱蜡后,蒸馏水洗涤5min3次,将切片放入盛有枸橼酸盐的缓冲液（pH6.0）的容器中,置微波炉内加热,在92℃～95℃之间持续10～15min,室温冷却10～20min。

蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min。

50g/L山羊血清封闭1h,加入待测的抗体,4℃冰箱放置过夜。

次日,PBS冲洗5min3次,加HRP-抗M13或HRP-羊抗人Fab,室温放置2h,继续PBS冲洗5min3次,加入DAB显色,复染,封片。

2结果2.1可溶性Fab抗体的表达及检测将获得的3株人源抗膀胱癌噬菌体抗体以NheI酶切,除去噬菌体抗体表达载体中的基因Ⅲ片段,得到可溶性Fab段的表达质粒,用其转化大肠杆菌XL1-Blue,经阿拉伯糖诱导制备可溶性Fab上清,用HRP-羊抗人Fab进行ELISA检测,证明该Fab段能特异地与EJ细胞结合（表1）。

表1可溶Fab与EJ细胞结合的ELISA（略）2.2相对亲和力的测定硫氰酸铵洗脱法是比较不同抗体相对亲和力的一种方法［8］。

一般常用于比较可溶性单一抗原的相对亲和力,为确定其是否能够用于本实验中,首先检测了不同浓度硫氰酸铵对EJ细胞的影响。

结果显示在2mol/L浓度下,硫氰酸铵对固相化EJ细胞的抗原性无影响（图1）。

图1硫氰酸铵对固相化EJ细胞抗原的影响（略）在此基础上现用该方法比较了所获人源与鼠源BDI噬菌体抗体的相对亲和力,表明经过CDR3引导所获得的人源抗体阳性克隆中,其中的2个克隆的亲和指数比较低,均为0.25mol/L,1个克隆的亲和指为0.7mol/L,接近于鼠源的亲和指数（0.9mol/L）的水平（图2）。

图2抗体相对亲和力的测定（略）2.3肿瘤组织免疫组化实验为进一步确定所筛选的人源抗体的特异性,现又用确诊的膀胱癌组织的石蜡切片进行了免疫组化实验,其所筛选到的人源抗膀胱癌抗体能够与膀胱癌组织特异结合（图3）。

图3免疫组化鉴定人源抗膀胱癌抗体Fab（SP,100）（略）A:正常组织;B:膀胱癌组织.3讨论BDI是一株对膀胱癌细胞具有高特异、高亲和性的抗膀胱癌mAb,在放射免疫诊断和治疗试用中取得良好的效果。

为使其更好的用于临床,在克隆BDI轻、重链基因的基础上,通过构建含鼠mAbBDICDR3区基因的人源抗体库,利用cre-loxp定位重组系统构建大容量抗体库。

用EJ细胞对所获的抗体库进行筛选,获得了3株与EJ细胞具有特异结合活性的人源化的噬菌体抗体。

与嵌合抗体的竞争抑制实验显示所获的噬菌体抗体与亲本鼠mAb识别相同的抗原表位。

通过对所获阳性克隆可变区序列测定,显示所获得的克隆均为人源Fab,抗体的基因与人胚系免疫球蛋白基因库中的基因有极高的同源性。

在本实验中,当把得到的3个克隆表达为可溶性Fab分子后,ELISA结果显示,尽管3个克隆均能够与EJ细胞特异性结合,只有一株可溶性克隆显示出较高的特异性,可能是噬菌体抗体利用噬菌体展示技术将抗体蛋白展示在噬菌体表面,噬菌体表达的抗体数量有几倍得到几十倍的放大,结果显示亲和力高［9］。

说明尽管用CDR3导向抗体库法能够获得与鼠mAb识别相同表位的人源抗体,要想获得具有高亲和力的具有临床应用前景的抗体,还需进一步进行体外亲和力成熟实验。

在本实验中,我们还运用硫氰酸铵洗脱法比较了所获人源与鼠源BDI噬菌体抗体的相对亲和力,尽管结果显示其中一个克隆的亲和指数为0.7mol/L,接近于鼠源的亲和指数（0.9mol/L）的水平,由于噬菌体抗体具有一定的放大效应,要想得到准确的结果,还需进一步试验验证,相关工作正在进行中。

【参考文献】［1］JespersLS,RobertsA,MahlerSM,etal.Guidingtheselectionofhumanantibodiesfromphagedisplayrepertoirestoasingleepitopeofanantigen［J］.BioTechnology,1994,12（9）:899-903.［2］WangZZ,WangY,LiZF,etal.HumanizationofamousemonoclonalantibodyneutralizingTNF-byguidedselection［J］.JImmunolMethods,2000,241(1-2):171-184.［3］周丽君,王琰,王堃,等.用CDR3导向抗体库法对鼠抗人膀胱癌单抗进行人源化［J］.中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(2):150-154.［4］白银,王琰,周丽君,等.抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达［J］.北京大学学报（医学版）,2001,33（5）:402-406.［5］李竟,王琰,王卓智,等.抗胃癌鼠单抗3H11Fab段载体的构建、表达及抗体活性检测［J］.中华微生物学和免疫学杂志,1999,19（2）:158-161.［6］周丽君,白银,王琰,等.抗膀胱癌单抗Fab段基因的克隆及表达［J］.中国肿瘤生物治疗杂志,2002,9(2):117-121.［7］王刚,王琰.用硫氰酸盐洗脱法筛选高亲和力噬菌体抗体［J］.中国免疫学杂志,2002,18（2）:93-95.