【近代探析测试技术论文：红外光谱的应用探究4900字】

-13-近代分析测试技术论文：红外光谱的应用研究摘要微生物检测常规方法通常耗时、对样品有破坏性，并且需要熟练的人员进行操作，无法进行大规模的无损筛查检测、实时和现场分析。本项目以黄曲霉、乳酸菌、酵母菌为例，利用荧光光谱技术和红外光谱技术采集数据，对光谱进行比较分析，为拓展光谱在微生物检测中的快速研究提供理论支撑。三者的红外光谱展现的官能团的特征峰不相同，黄曲霉在1540cm-1处出现苯环的变形，表现为其特征峰；酵母菌在2846cm-1处的波动由于C-H的伸缩振动产生；但是乳酸菌在2846cm-1处并未发生明显波动，并且乳酸菌的透过率数值相对于酵母菌透过率的数值更小；混合菌粉展现出的红外光谱与单一的菌种相似。三者的荧光光谱展现的不同激发光产生荧光强度不相同，黄曲霉在波长300nm左右荧光强度较强，酵母和乳酸菌的在500-600nm左右荧光强度较为明显；混合之后的菌粉展现出与单菌相似的荧光光谱图，黄曲霉毒素的成分或者所含基团浓度含量有所降低。说明酵母菌和乳酸菌的混合可能延缓或者抑制了黄曲霉的生长。关键词：荧光光谱技术；红外光谱技术；微生物目录TOC\o"1-3"\h\u203251引言 1306762材料与方法 294102.1实验材料 262662.1.1菌株 2179782.1.2培养基 2309682.1.3试剂与仪器 2268032.2方法 235372.2.1样品制作 2237982.2.2红外光谱信息采集 386332.2.3荧光光谱信息采集 3132603结果与讨论 3142534结论 911311参考文献 111引言光谱检测技术是一种方便、实时、无损的检测技术。荧光光谱是一种分析技术，其理论和方法在化学和生物化学学科中都得到了广泛的应用，例如研究小分子、合成聚合物、蛋白质和其他生物分子的结构、功能和反应性等。然而，它最近才成为食品科学领域的流行工具。在过去的二十年里，荧光光谱在食品分析中的应用显着增加，并已被证明是表征各种食品的化学成分、检测危害和鉴定分析的有用工具。荧光是荧光分子或子结构（称为荧光团）吸收紫外(UV)或可见(Vis)光后发射的光[13]。荧光团以特定波长的光的形式吸收能量，并以发射更长波长的光的形式释放能量。典型的荧光过程涉及三个步骤，即激发、振动弛豫/内转换和发射。入射光对敏感分子的激发发生在飞秒内，在此期间光被分子吸收并转移到电子激发态。振动弛豫/内部转换是指分子在没有任何辐射的情况下从高电子激发态跃迁到低电子激发态的过程。最后的过程包括发射更长波长的光并将分子返回到基态。许多化合物在被紫外辐射激发时会在可见光谱区域发出荧光。Marsh[14]及其同事首先报道了在被黄曲霉感染的棉铃中观察到亮绿黄色荧光，随后将棉籽中的黄曲霉毒素与纤维中的亮绿黄色荧光相关联。据报道，荧光是由活植物中的过氧化物酶与曲酸反应产生的，曲酸是由曲霉菌类型形成的。黄曲霉毒素在紫外光照射下会发生荧光现象，特别是AFB和AFG这两个主要基团分别可以发出亮蓝色（425-480nm）和蓝-绿色（480-500nm）光谱范围内的荧光。傅里叶红外光谱法是通过测量干涉图和对干涉图进行傅里叶变化的方法来测定红外光谱。具有高质量的特性，例如快速扫描、额外的灵敏度、价格低廉，已成功用于表征真菌样品的化学成分。真菌等生物样品的鉴定和表征不需要更多的时间，只需要少量的真菌样品，大约15毫克粉末状样品。FTIR光谱显示通过每个样品的“分子指纹”在基因水平上鉴定和表征曲霉属的高精度结果。红外辐射落在样品上，其中一些被吸收，一些被吸收，吸收的辐射能量与真菌化学成分（如脂肪酸、蛋白质、多糖）中的分子键振动和官能团相互作用、碳水化合物、核酸和芳香族化合物，然后显示特定的波数，形成每个曲霉样品的特征光谱[15]。傅里叶变换红外光谱已成为识别和量化食品中特定成分和掺杂物的强大分析工具。它已广泛用于食品研究。该技术与原子力显微镜和氨基酸分析、差示扫描量热法、小角X射线散射和原子力显微镜等其他技术相结合[16]，已被用于研究食品材料的化学成分、结构和物理性质。傅里叶变换红外光谱已成功用于检测花生和玉米中的黄曲霉毒素，具有更好的预测能力和模型性能。基于以上研究，本项目主要利用三维荧光光谱技术和傅里叶红外光谱技术对霉菌、酵母菌、细菌等微生物快速检测进行比较研究，为微生物测定提供新的思路。2材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株工业菌种中心购买的黄曲霉；实验室保存乳酸菌，酵母菌。2.1.2培养基马铃薯葡萄糖水培养基，MRS培养基。2.1.3试剂与仪器主要试剂：溴化钾，无水乙醇，去离子水。仪器：精密天平，压片机，傅里叶红外光谱仪，摇床，荧光光谱仪，培养箱，超净工作台，灭菌锅，真空泵抽滤机，冷冻干燥机。2.2方法2.2.1样品制作挑取黄曲霉单菌落于灭菌的含100mLPDB培养液的锥形瓶中，于28℃，160r/min，振荡培养24h。将酵母菌液体培养基（5mL菌液接入100mLPDB），在28℃环境下，用恒温水浴摇床160r/min振荡培养24h。将乳酸菌液体培养基乳酸菌（5mL菌液接入100mLMRS液体培养基）在37℃恒温培养箱培养48h。将上述菌液分别置于真空泵抽滤机抽滤，用去离子水冲洗三次，转至塑料平板内，覆上一层保鲜膜（膜上均匀打孔），然后放入冷冻干燥机进行干燥处理，得到菌粉。2.2.2红外光谱信息采集取菌粉1mg、溴化钾100mg于玛瑙研钵充分研磨混合，再用压片机进行压片。采集每份样品的红外光谱。所有样品光谱采集纪录三次并保存光谱数据，绘制红外图谱。光谱范围是500-4000cm-1。2.2.3荧光光谱信息采集取红外光谱信息采集所用的压片，置于小烧杯中，加去离子水10ml，用玻璃棒搅拌至充分溶解，移入石英比色皿中进行荧光光谱信息采集。所有样品光谱采集纪录三次并保存光谱数据，绘制荧光图谱。同步荧光光谱参数设置：激发波长（Ex）为200~600nm，增量为1nm，通过同时扫描激发单色仪和发射单色仪，在10~180nm范围内以10nm恒定的间隔波长（△λ），扫描速度为1200nm/min。3结果与讨论黄曲霉的红外光谱图如图1所示。在3500-3000cm-1和2000-1000cm-1的光谱区域，波峰和波谷的变化非常明显。这些差异可能归因于样品的生化成分和红外光谱的相互作用。该界面生成不同分子和官能团的特征光谱。3400-3300cm-1区域观察到的进一步弯曲可能归因于OH基团的存在。2923cm-1归属于亚甲基（-CH2-)组。1024cm-1用于对称拉伸双键C单键O单键C或苯基的对称弯曲。1232cm-1处吸收为C-O-C不对称伸缩振动。1649cm-1峰归属于顺式双键拉伸（=C-H）。1399cm-1处表现出特征吸收带与环氧树脂环相邻。2,3-二氢呋喃环拉伸与1079cm-1处的峰相关C-O四氢呋喃与1149cm-1处的峰相关。3004-2969cm-1对于CH2、芳族双键CH、CH、C单键C和苯基[17]。值得注意的是，在1540cm-1处出现苯环的变形，可表现为黄曲霉的特征峰。图1黄曲霉红外光谱酵母菌的红外光谱图如图2所示。在3500-1000cm-1的光谱区域，峰和谷的变化非常明显，该区域的特点是各种脂肪酸链、磷脂的振动和一些氨基侧链的振动。CH的典型带的存在：1649cm-1，C-O酰胺I的轴向变形；1339cm-1，CH3的对称角变形。在1719cm-1处观察到与芳环共轭的羰基，在1506cm-1处观察到芳烃中的C-C信号。1272cm-1处的谱带是由于涉及芳族基团碳的不对称伸展。在1040cm-1处有一个微妙的带，这是SO3-群对称振动的特征。544cm-1处的信号对应于芳烃的伸展[18]。有趣的是，在2846cm-1处的波动由于C-H的伸缩振动产生。图2酵母菌红外光谱乳酸菌的红外光谱图如图3所示。虽然与酵母菌的红外光谱相似，可能是因为两者结构相似，但是也有细微的官能团发生一定的偏移。乳酸菌收集的4000-500cm-1范围内的典型红外光谱数据。在1649cm-1处观察到一个主峰，反射水（O-H）和酰胺I带（80%C=O拉伸、10%CN拉伸和10%N-H弯曲）。在1079cm-1处观察到次要峰（C-O拉伸、酯类C-O-C、乳糖碳水化合物C-O拉伸和-NH2变形）、1110cm-1（核糖C-O拉伸、胺NH2摇摆/扭曲）、1065cm-1（核酸和磷脂PO2对称拉伸/C-O拉伸）和1040cm-1（乳糖、碳水化合物C-O拉伸）[19]。与酵母菌的红外光谱的不同之处在于在2846cm-1处并未发生明显波动，并且乳酸菌的透过率数值相对于酵母菌透过率的数值更小。图3乳酸菌红外光谱黄曲霉和酵母菌的混合菌粉以及黄曲霉和乳酸菌的混合菌粉的红外光谱如图4-5所示，黄曲霉和酵母菌的混合菌粉与酵母菌的红外光谱相似，可能原因是黄曲霉和酵母菌的混合之后，酵母菌在其中的官能团起主要作用。同样的，黄曲霉和乳酸菌的混合菌粉的红外光谱与乳酸菌的红外光谱也是相似的，官能团结构表现为乳酸菌展现出如上述相似的结构。但是，混合后的红外光谱图出现些许跳动的瑕疵，可能是由于黄曲霉的加入出现这种现象。图4黄曲霉和酵母菌的混合菌粉的混合菌粉红外光谱图5黄曲霉和乳酸菌的混合菌粉的混合菌粉红外光谱进一步对黄曲霉、酵母菌和乳酸菌进行荧光分析。图6-10显示了单一菌及混合物的同步荧光光谱图。图6-8为黄曲霉、酵母菌和乳酸菌的同步荧光光谱对于Δλ和Ex均表现出从20到180nm和从200到600nm的强度区域。同步荧光信号由荧光物质产生。在这个时期，这些荧光物质与色素、生育酚、共轭二烯、水解产物、叶绿素和脱镁叶绿素有关。黄曲霉在波长300nm左右荧光强度较强，可能是黄曲霉毒素发出的荧光。酵母菌和乳酸菌的在500-600nm左右荧光强度较为明显，可能是蛋白荧光。对黄曲霉和酵母菌的混合菌粉以及黄曲霉和乳酸菌的混合菌粉的荧光光谱进行分析（图7-8），发现通过酵母菌和乳酸菌的混合，500-600nm左右的特征峰依旧存在，而300nm左右黄曲霉的特征峰颜色鲜艳程度变弱了，表明黄曲霉毒素的成分或者基团浓度含量降低了，可能酵母菌和乳酸菌的混合生长可能延缓或者抑制了黄曲霉的生长。结果表明，该方法对菌种的检测是可行的。图6黄曲霉荧光光谱图7酵母菌荧光光谱图8乳酸菌荧光光谱图9黄曲霉和酵母菌的混合菌粉的混合菌粉荧光光谱图10黄曲霉和乳酸菌的混合菌粉的混合菌粉荧光光谱4结论项目利用三维同步荧光和红外荧光光谱对黄曲霉、酵母菌及乳酸菌进行了快速检测，表明：（1）黄曲霉、酵母菌及乳酸菌三者的红外光谱展现的官能团的特征峰不相同。黄曲霉在1540cm-1处出现苯环的变形，表现为其特征峰。乳酸菌与酵母菌的红外光谱相似，可能是因为两者有官能团相似，但是也有细微的官能团发生一定的偏移，酵母菌在2846cm-1处的波动由于C-H的伸缩振动产生；但是乳酸菌在2846cm-1处并未发生明显波动，并且乳酸菌的透过率数值相对于酵母菌透过率的数值更小。然而，黄曲霉和酵母菌的混合菌粉展现出的红外光谱与单一的酵母菌相似；曲霉和乳酸菌的混合菌粉的红外光谱与乳酸菌的红外光谱也是相似的，可能原因是黄曲霉在混合菌粉中特征官能团变弱，未展现于红外光谱中。（2）黄曲霉、酵母菌及乳酸菌三者的荧光光谱展现的不同激发光产生荧光强度不相同。黄曲霉在波长300nm左右荧光强度较强，酵母和乳酸菌的在500-600nm左右荧光强度较为明显。混合之后的菌粉展现出与单菌相似的荧光光谱图，在混合后的光谱图中可以发现500-600nm左右的特征峰颜色鲜艳，而300nm左右的特征峰颜色鲜艳程度变弱了。而300nm左右的特征峰表现为黄曲霉的特征峰，所以结果表明黄曲霉毒素的成分或者所含基团浓度含量降低了。说明酵母菌和乳酸菌的混合可能延缓或者抑制了黄曲霉的生长。总体结果表明，荧光光谱技术联合红外光谱技术有助于及时快速检测微生物变化。参考文献[1]王放．食品营养保健原理与技术：中国轻工业出版社，1996[2]许国龙.正确认识霉菌及其毒素的危害[J].今日畜牧兽医,2021,37(08):79.[3]王晓佳.饲料中常见霉菌毒素的种类及危害[J].粮油与饲料科技,2021(03):33-38.[4]金昌福,张强,郑先哲.贮藏稻谷霉菌菌落总数近红外光谱预测模型[J].农机化研究,2016,38(10):160-164.[5]刘桐,刘爽,司南,苑帅,任大勇,陈萍.霉菌和酵母菌检测技术的研究进展[J].农产品加工,2018(12):73-75..[6] 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