菌种扩大培养

关于菌种扩大培养绪论发酵的定义：利用微生物、动物和植物细胞的酶合成目的产物的过程。发酵工程的两个里程碑：显微镜和通气发酵罐第2页,共63页，星期六，2024年，5月第一节、概述第二节、种子制备的一般流程第三节、菌种生物活性检测第四节、实验室种子扩大培养第五节、种子质量控制措施

主要内容

第3页,共63页，星期六，2024年，5月第一节、概述1、定义：菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过茄氏瓶和种子罐逐级扩大培养，满足发酵所需种子的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。

第4页,共63页，星期六，2024年，5月2、目前的发展趋势菌种的扩大培养与发酵相分离——种子生产形成工业化：酒精工业酿造工业生物转化某些特除代谢物菌体细胞固定化发酵无细胞发酵体系第5页,共63页，星期六，2024年，5月

目的：1）.生理适应：让菌种从固体试管、液体试管……，逐步适应发酵罐的要求。如：啤酒酵母

2）.质量满足：提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。

a、缩短发酵周期、降低能耗、减少染菌的机会

b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。

3).可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。要求：纯种。3、菌种扩大培养的目的及要求：第6页,共63页，星期六，2024年，5月

4.作为种子必备的条件：1）生命旺盛有活力，移种后，能迅速生长，缩短延滞期。2）菌体总量适宜，保证发酵罐的接种量。3）遗传表现性要稳定；4）菌种要纯。无杂菌污染。5）保持稳定的生产能力返回第7页,共63页，星期六，2024年，5月第二节、从保存菌种到生产用种子的一般流程第8页,共63页，星期六，2024年，5月确定流程的原则：1、保证发酵罐的菌种质和量；2、尽量缩短流程、以防治染菌。考虑因素：1、发酵罐的体积2、菌种的特性3、工艺上菌种量的要求第9页,共63页，星期六，2024年，5月主要步骤菌种生物活性检测实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养）生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养返回第10页,共63页，星期六，2024年，5月第二节、菌种生物活性检测返回第11页,共63页，星期六，2024年，5月第三节、实验室种子扩大培养一、固体种子制备二、液体种子制备第12页,共63页，星期六，2024年，5月概念：种子罐的级数：种子在种子罐中扩大培养的次数。发酵罐的级数：种子罐数加一。接种量：是指移入的种子液体体积和接种后培养液体积的比例。或移入的种子液体积占接种前培养液体积的百分数。种龄：生产种子时的培养时间。孢子制备：用固体培养的种子叫孢子制备。种子制备：用液体培养的种子叫种子制备。第13页,共63页，星期六，2024年，5月种子制备的工艺流程通常有两种方法：固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于酿造业，有霉菌的纯培养，也有混合培养如：大曲液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业液体培养为主导方式。第14页,共63页，星期六，2024年，5月

斜面孢子孢子米粒孢子种曲菌体

一、固体菌种（一）固体菌种制备第15页,共63页，星期六，2024年，5月1、斜面菌种的制备定义：在试管或扁瓶（茄子瓶）内，以琼脂固化的培养基表面生长的菌种培养物。斜面种子制备流程：培养基→分装→灭菌→冷却→摆斜面→接种恒温培养→斜面种子制备中应注意的问题：1、琼脂的用量2、装量3、减少冷凝水4、不含有沉淀的固体物，用蒸馏水或去离子水5、微量元素先配成一定的，用移液管定量加入第16页,共63页，星期六，2024年，5月2、米粒孢子（米孢子）

米孢子：霉菌的孢子培养，接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后所产生的孢子。优点：⑴保存期较长，可用半年以上。⑵孢子量大，107-108个孢子/g米粒。质量标准：1.无杂菌污染，每500瓶抽样检查1-2瓶；2.足够孢子数，发芽率80%；3.生产能力高；4.真空干燥后含水率小于8%；第17页,共63页，星期六，2024年，5月大米或小米↓水洗↓沥干↓分装↓混匀↓灭菌↓接种（摇匀）↓培养↓米孢子制备工艺流程：斜放，且摇翻动注意事项：1、浸泡时间及加营养液的量应掌握在灭菌后米粒熟透而不粘连。2、分装量2-3厘米厚度3、米粒不要碰在瓶口4、前期摇动，后期不要再动5、米粒可存放半年，冰箱4℃、真空干燥蜡封。无菌蒸馏水↓斜面孢子↓孢子悬浮液第18页,共63页，星期六，2024年，5月3、种曲培养材料：麸皮、米糠、木屑、稻壳等柠檬酸、酱油、醋、糖化酶放线菌孢子的制备：琼脂斜面培养基，碳源和氮源不要太丰富，干燥和限制营养可诱发孢子形成。培养温度28℃，少数37℃；培养时间5-14天。霉菌孢子的制备：一般采用米孢子或种曲，培养温度25℃-28℃，培养时间4-14天。细菌孢子的制备：琼脂斜面培养基，碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨。培养温度37℃，少数28℃；培养时间一般1-2天，产芽孢的细菌5-10天。第19页,共63页，星期六，2024年，5月（二）、固体种子质量控制措施影响孢子以及斜面质量的因素及控制影响孢子质量的因素通常有：原材料的质量灭菌条件培养条件培养时间冷藏时间接种量有害气体和挥发物第20页,共63页，星期六，2024年，5月

1、原材料的质量麸皮：蛋白胨：无机离子含量不同：微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。水质的影响菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。第21页,共63页，星期六，2024年，5月解决措施（1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；（2）严格控制灭菌后培养基的质量；（3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；（4）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。第22页,共63页，星期六，2024年，5月2、培养条件（1）温度（2）湿度（培养基内湿度，培养基外湿度）不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响第23页,共63页，星期六，2024年，5月

3、培养时间和冷藏时间（1）培养时间解决措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。（2）冷藏时间冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如庆大霉素生产中，孢子4℃冷藏15天，发酵单位比不冷藏的提高12－14％，孢子在链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。第24页,共63页，星期六，2024年，5月接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。第25页,共63页，星期六，2024年，5月二次生长

孢子斜面制备过程中由于营养过于丰富，或者湿度过大引起斜面上刚长出的孢子萌发形成菌丝体。同步生长(synchronousculture)：同步培养是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。第26页,共63页，星期六，2024年，5月

二、液体种子制备——好氧培养

对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：试管→三角瓶→摇床→种子罐第27页,共63页，星期六，2024年，5月

液体种子培养——厌氧培养

对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下：试管→三角瓶→卡式罐→种子罐第28页,共63页，星期六，2024年，5月制备过程中注意事项：⑴营养比斜面要丰富，保持pH稳定⑵装量要适当，保持良好的通气；好氧培养三角瓶40-50mL/250mL、60~80mL/500mL、90-110mL/750mL、120-150mL/1000mL。厌氧培养时装液量增加一倍。⑶灭菌时要注意棉塞不要被打湿。⑷摇床转速。⑸注意摇床上下、边缘、中心的温差。第29页,共63页，星期六，2024年，5月三、实验室菌种质量标准无污染,菌落形态一致。性能稳定第30页,共63页，星期六，2024年，5月实例：生产啤酒的酵母菌制作返回第31页,共63页，星期六，2024年，5月实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养种子罐培养作用①、使菌种获得足够的数量，②、种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境

③、使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长。

第四节、生产车间种子制备第32页,共63页，星期六，2024年，5月第33页,共63页，星期六，2024年，5月第34页,共63页，星期六，2024年，5月第35页,共63页，星期六，2024年，5月1、种子罐接种常用接种方法火圈保护法压差法接种第36页,共63页，星期六，2024年，5月第37页,共63页，星期六，2024年，5月2、种子罐级数确定种子罐级数的因素：

（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；（2）所采用发酵罐的容积。确定种子罐级数需注意的问题（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数第38页,共63页，星期六，2024年，5月细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶→种子罐→发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用二级种子第39页,共63页，星期六，2024年，5月3、影响种子罐种子质量的因素1、培养基：逐步接近发酵培养基2、培养条件：温度、溶氧3、种龄：对数生长期的菌丝细菌霉菌放线菌

7-24h16-50h21-64h.4、接种量；第40页,共63页，星期六，2024年，5月

接种种龄的影响

第41页,共63页，星期六，2024年，5月接种量的影响通常采用的接种量细菌1~5%酵母菌5~10%霉菌7~15%，有时20~25%植物细胞：30－50％第42页,共63页，星期六，2024年，5月接种量影响接种量的因素：菌种生长速度一般情况下：以大接种量较为适合适合的接种量的重要性：过大：菌丝生长过快，粘稠，营养基质缺乏，溶氧不足过小：菌丝体生长缓慢，发酵周期延长，产生菌丝团第43页,共63页，星期六，2024年，5月培养基的影响种子培养基成分要满足以下要求：（1）营养成分适合种子培养的需要（2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；（3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用；（4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高，并且成分尽可能与发酵培养基成分一致。（5）营养成分、液体环境（渗透压、氧化还原电极电位、pH、水的离子活度等）要尽可能与发酵培养基相近。

第44页,共63页，星期六，2024年，5月

pH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速度。质子是一种唯一不带电子的阳离子，它在溶液里能迅速地与水结合成水合氢离子(H3O+等)。在偏碱性条件下，0H-占优势，水合氢离子和0H-对营养物质的溶解度和解离状态，细胞表面电荷平衡和细胞的胶体性质等方面均会产生重大影响；在酸性条件下，H＋可以与营养物质结合，并能从可交换的结合物或细胞表面置换出某些阳离广，从而影响纫胞结构的稳定性；同时由于pH值较低，CO2溶解度降低，某些金属离子如Mn2＋、Ca2+等溶解度增加，导致它们在溶液中的浓度增加，从而对机体产生不利的作用。培养基的pH的影响第45页,共63页，星期六，2024年，5月第46页,共63页，星期六，2024年，5月图：原核生物细胞膜上的电子传递链第47页,共63页，星期六，2024年，5月图：与膜结合的ATP合成酶的结构和功能第48页,共63页，星期六，2024年，5月第49页,共63页，星期六，2024年，5月

pH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速度。质子是一种唯一不带电子的阳离子，它在溶液里能迅速地与水结合成水合氢离子(H3O+等)。在偏碱性条件下，0H-占优势，水合氢离子和0H-对营养物质的溶解度和解离状态，细胞表面电荷平衡和细胞的胶体性质等方面均会产生重大影响；在酸性条件下，H＋可以与营养物质结合，并能从可交换的结合物或细胞表面置换出某些阳离广，从而影响细胞结构的稳定性；同时由于pH值较低，CO2溶解度降低，某些金属离子如Mn2＋、Ca2+等溶解度增加，导致它们在溶液中的浓度增加，从而对机体产生不利的作用。培养基的pH的影响第50页,共63页，星期六，2024年，5月培养的工艺条件的影响培养温度搅拌溶氧通气第51页,共63页，星期六，2024年，5月温度对微生物生长的影响具体表现在：①影响酶活性，微生物生长过程中所发生的一系列化学反应绝大多数是在特定酶催化下完成的，每种酶都有最适的酶促反应温度，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞物质合成。②影响细胞质膜的流动性，温度高流动性大，有利于物质的运输，温度低流动性降低，不利于物质运输，囤此温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。③影响物质的溶解度，物质只有溶于水才能被机体吸收或分泌，除气体物质以外，温度升高，物质的溶解度增加，温度降低物质的溶解度降低，最终影响微生物的生长。返回第52页,共63页，星期六，2024年，5月

第五节、种子质量的控制措施

菌种稳定性的检查：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用

种子液生化分析项目：营养消耗的速度，pH变化，溶氧利用情况，色泽、气味是否异常等。杂菌检查：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检

第53页,共63页，星期六，2024年，5月

1.种子质量标准

1）．细胞或菌体指标：菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观。形态：单细胞菌体－－－菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。霉菌、放线菌－－－菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。生长量：常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。外观：如颜色、粘度等。

第54页