3.2.1基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第1课时目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建第3章基因工程人教版高中生物选择性必修3第2节基因工程的基本操作程序

情境导入转基因抗虫棉你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。非转基因抗虫棉转基因抗虫棉培育转基因抗虫棉的四个步骤与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉

（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？过渡

目的基因的筛选与获取一基因表达载体的构建二目录一

目的基因的筛选与获取一1.目的基因在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。苏云金芽孢杆菌产生Bt基因伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）表达破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫导入抗虫棉培育棉花细胞1概念：2实例：主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子（1）从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。（2）利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。Bt蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。一

目的基因的筛选与获取一

2.筛选合适的目的基因方法：前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成DNA合成仪

蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成一

目的基因的筛选与获取一

3.获取目的基因的方法1人工合成目的基因2通过构建基因文库来获取目的基因3常用PCR特异性地快速扩增目的基因一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因提取？苏云金芽孢杆菌抗虫基因快速获得大量抗虫基因（1）PCR——聚合酶链式反应的概念、原理PCR需要什么条件呢？先来回顾DNA的复制！过渡PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA半保留复制穆里斯解旋合成子链复旋1概念：2原理：PCR反应过程分析任务一利用PCR获取和扩增目的基因需要哪些条件？PCR反应的基本过程是怎样的？【自主学习】阅读教材P77-79，结合图3-5，回答以下问题：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）四种脱氧核苷三磷酸（dNTP））DNA模板引物稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）PCR仪3基本条件：一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因引物引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。用于四种脱氧核苷三磷酸（dNTP））一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）四种脱氧核苷三磷酸（dNTP））DNA模板引物稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）PCR仪3基本条件：一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）ATCGP

~

P

~

P脱氧核糖含氮碱基脱氧核苷酸dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写，N是指A、T、G、C四种含氮碱基，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。它们是由两个磷酸分子和一个脱氧核苷酸组成的，其结构简式如下：一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因一定量的模板DNA引物4中脱氧核苷酸dNTP缓冲液热稳定DNA聚合酶（Taq酶）Mg2+作为DNA复制的模板使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料提供相对稳定的pH环境催化合成DNA子链真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活3基本条件：一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。变性延伸复性4PCR反应过程：一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式扩增（约为

，其中n为扩增循环的次数）。指数2n常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。变性90℃以上延伸72℃左右复性50℃左右基本过程5PCR的结果：6PCR产物的鉴定：一

目的基因的筛选与获取一

4.利用PCR获取和扩增目的基因视频：PCR反应过程PCR反应过程分析任务二图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。不是完整的模板DNA分子；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。PCR反应过程分析任务二2.图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’第3轮；1/4。PCR反应过程分析任务二5’5’3’3’5’5’3’3’第1次5’5’5’5’3’3’3’3’第2次3’3’5’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’第3次3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’3’3’5’3’3’3’3’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’5’5’第4次1个3个4个1个3个4个4．图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列），都不合理，请分别说明理由。第1组：

；第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。PCR反应过程分析任务二5．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。6．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？共需消耗2n－1对引物。PCR反应过程分析任务二跟踪训练1.（2023·山西太原高二诊断）下列有关获取目的基因的叙述，错误的是A.目的基因就是编码蛋白质的基因B.获取目的基因是基因工程的第一步C.来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会√目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧

核苷酸连接到引物的3′端B.在第三轮循环产物中开始出现两条

脱氧核苷酸链等长的DNA片段C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4跟踪训练√跟踪训练由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的DNA分子是7个，即占7/8，D错误。

目的基因的筛选与获取一基因表达载体的构建二目录一

基因表达载体的构建二苏云金杆菌中的Bt基因普通棉花细胞含Bt基因的棉花细胞能产生Bt抗虫蛋白的棉花植株转入植物组织培养技术形成使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。基因工程的核心工作1目的：获取Bt基因后能不能直接将它导入受体细胞呢？一

基因表达载体的构建二2组成：DNA复制的起始位点位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。位于基因的下游；终止转录便于重组DNA分子的筛选和鉴定。能控制表达所需要的特殊性状基因表达载体的构建的分析任务三启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达1.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？标记基因启动子插入目的基因终止子复制原点限制酶切割位点①

用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。②

用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。载体基因表达载体一

基因表达载体的构建二3构建过程：基因表达载体的构建的分析任务三载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’12.使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况?基因表达载体的构建的分析任务三3.限制酶的选择原则如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。（1）不破坏目的基因原则：（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：基因表达载体的构建的分析任务三通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接）可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。（3）确保出现相同黏性末端原则：3