高效液相色谱法测定黄酮

高效液相色谱法测定金线莲中黄酮含量金线莲为兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoec-tochilus)珍稀濒危药用植物,主产于我国福建、台湾和云南等省，其中福建金线莲[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.]为主要药用种之-一川。该植物主要用于治疗高血压、糖尿病、肝炎、肾炎等症,疗效独特2),素有“药王”、“金草”之称。目前野生金线莲日渐匮乏,且市场较为混乱，急切需要科学的方法对金线莲药用种加以甄别。本文在对福建金线莲系统的化学研究结果基础上,对其主要成分黄酮进行定性及定量分析，并比较了同为开唇兰属,而未作为金线莲主要药用种的云南金线莲(AnoectochilusburmannicusRolfe)与福建金线莲黄酮苷元类型和含量的差异,从而为金线莲的种间鉴别、人工栽培等研究提供依据。福建金线莲化学成分研究的结果表明,该植物中富含黄酮类化合物,结构以异鼠李素、槲皮素及山柰素型黄酮醇苷为主[2-4]。而总黄酮含量以及3种主要类型黄酮含量之比是金线莲质量控制的重要指标，因此有必要建立金线莲中黄酮类化合物的含量测定方法，为金线莲种的鉴别以及人工栽培方法等研究奠定化学基础。总黄酮含量测定通常使用紫外分光光度法及高效液相色谱法,后者选择性优于前者。本文对金线莲乙醇提取物进行酸水解处理，采用高效液相色谱法测定其水解所得主要苷元:异鼠李素槲皮素和山柰索的含量,计算3种黄酮苷元总含量及其比例，对比福建金线莲与云南金线莲之间黄酮类化学成分的差别。1仪器、试剂与材料美国Waters公司高效液相色谱仪:Waters600控制器,616泵,996二极管阵列检测器,2010工作站。对照品:槲皮素、异鼠李素为本室自制,纯度95%以，上(以NMR和MS鉴定结构，以HPLC一ELSD鉴定纯度)。甲醇(色谱纯):天津四友生物医学技术有限公司;乙腈(色谱纯):MerckKGaA，Fish-ierChemAlert;95%乙醇(分析纯):北京化工厂;85%磷酸(分析纯)福建金线莲(Anoectochilusroxburghii)与云南金线莲(Anoectochilusburmannicus)干燥药材均由郭顺星研究员提供并鉴定。药材自然干燥后粉碎,过40目筛作为待测样品。2色谱条件色谱柱:Waters公司SymmetryCg(5μm,3.9mmx150mm);Waters公司SymmetryC18预柱;流动相:乙腈-0.03%磷酸水溶液(24:76)，流速:1.0mL。min,检测波长:370nm,柱温:35C。3.溶液制备3.1对照品混合溶液精密称取经五氧化二磷干燥过夜的对照品槲皮素、异鼠李索适量,分别加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，分别取此2种溶液均为0.1,0.5,1.0,2.0,3.0,5.0mL,置于同一10mL量瓶中,配制槲皮素和异鼠李素浓度分别为5.900,5.005μg。mL-;29.50,25.02μg°mL~;59.00,50.05μg，mL~';118.0,100.1μg。mL~';168.0,150.2μg，mL-';295.0,250.2μg。mL~'的对照品混合溶液。3.2供试品溶液取药材粉末0.5g,加95%乙醇6mL浸泡过夜，回流提取3次(6,6,6mL),每次1.5h,提取溶液转人25mL量瓶中，加95%乙醇至刻度,摇匀，取此溶液5mL,加甲醇-25%盐酸水溶液(4:1)12.5mL水解1h。水解物回收溶剂至干，加95%乙醇适量溶解，置于25mL量瓶中，加95%乙醇至刻度,摇匀。0.45μm滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。4方法学考察4.1线性关系考察精密量取“3.1”项下不同浓度的对照品混合溶液各20μL分别进样，以进样量(μg)与峰面积积分值进行线性回归。得到槲皮素和异鼠李素的线性回归方程以及相关系数分别为:m=4.5x10~A+0.052r=0.9998m=4.8x10~'A+0.026r=0.99964.2精密度试验按上述色谱条件,分别精密量取槲皮素和异鼠李素浓度分别为59.00,50.05μg，mL-'的对照品混合溶液,连续进样6次，每次进样20μL,测定各成分的峰面积，计算得槲皮素.异鼠李素的RSD分别为1.3%和1.4%。4.3重复性试验按照“3.2”项下方法制备供试品溶液5份,精密量取20μL进样,测量峰面积,计算槲皮素、山柰素和素异鼠李素3种苷元含量分别为0.032%,0.008%,0.046%;RSD分别为3.5%，1.6%,1.8%。重复性良好。4.4加样回收率试验精密称取福建金线莲约0.5g,加95%乙醇6mL,加人槲皮素浓度为0.1180mg，mL~'、异鼠李素浓度为0.1011mg.mL-的对照品混合溶液50μL。按照“3.2”项下方法制备供试溶液，重复操作5组,精密量取20μl进样。结果显示,槲皮素平均加样回收率为97.41%,RSD为3.7%;异鼠李素平均加样回收率为96.08%,RSD为3.9%。5.样品测定将福建金线莲和云南金线莲分别按“3.2”项下方法制成供试品溶液，进样20μL,外标法测定槲皮素和异鼠李素的含量,并以槲皮素为对照,根据槲皮素与山柰素质量数之比折算山柰素的含量,计算3种苷元的含量之和以及各苷元含量之比。福建金线莲苷元总含量约为0.086%,云南金线莲，总黄酮含量比福建金线莲总黄酮含量高68%，为0.134%。福建金线莲黄酮主要母核类型为:槲皮素型、山柰素型、异鼠李素型,三者含量之比约为4:1:6。云南产金线莲中三者含量之比约为1:1:10。图1反映了金线莲2个不同种之间黄酮类化合物结构的差异:福建金线莲中槲皮素和异鼠李素含量相当,山柰素含量最低;而云南产金线莲中黄酮母核集中于异鼠李素型，占总含量的80%以上。从黄酮类化合物结构多样性角度评价,福建金线莲优于云南产金线莲。6.讨论6.1利用HPLC-水解法首次证明，福建金线莲与云南产金线莲中黄酮类化合物母核类型主要为槲皮素、山柰素和异鼠李素型。同样作为金线莲使用的2种金线莲之间，黄酮苷元含量及黄酮结构类型存在显著差异。6.2HPLC-水解法对水解条件要求较为苛刻。参照文献[5],本实验分别考察了水解时间为45,60，90min时供试品溶液的黄酮苷元总含量,发现水解时间为60min时黄酮含量最高,在实验过程中必须使水解时间严格一-致