发酵工业无菌技术课件

第四章发酵工业的无菌技术4发酵工业无菌技术本章内容一、概念

二、发酵工业污染的防治策略三、发酵工业的无菌技术四、培养基及设备灭菌

五、空气除菌4发酵工业无菌技术一、概念灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。

消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。

除菌(degermation):用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。

防腐(antisepsis):用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖

。四者的区别在发酵工业中的应用4发酵工业无菌技术二、发酵工业污染的防治策略（一）污染的危害（二）污染的防治

染菌的不良后果

染菌危害的具体分析染菌的检查与判断污染原因分析预防4发酵工业无菌技术染菌的不良后果

消耗营养合成其他产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难改变pH分解产物噬菌体破坏极大4发酵工业无菌技术染菌危害的具体分析染菌对不同菌种发酵的影响杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响不同发酵时期染菌对发酵的影响4发酵工业无菌技术细菌谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。

霉菌PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。染菌对不同菌种发酵的影响124发酵工业无菌技术酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌

疫苗无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。染菌对不同菌种发酵的影响124发酵工业无菌技术种子扩大时期染菌

灭菌后弃去发酵前期染菌

应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种发酵中期染菌

挽救困难，应早发现，快处理，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定发酵后期污染染菌量不太多，可继续发酵污染严重，则提前放罐不同发酵时期染菌对发酵的影响4发酵工业无菌技术柠檬酸发酵

污染细菌

加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌污染酵母

加入0.025~0.035g/LCuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。污染黄曲霉

加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。污染青霉菌

在pH很低下能够生长。提前放罐。具体情况4发酵工业无菌技术丝状菌发酵被产酸菌污染 pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难

处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀杂菌分泌较多蛋白质杂质

对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响4发酵工业无菌技术显微镜检查法镜检出杂菌需要一定时间平板法

平板划线培养或斜面培养检查法：菌落噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑肉汤培养检查法发酵过程的异常现象判断DO2水平异常变化pH异常变化尾气CO2异常变化染菌的检查与判断4发酵工业无菌技术12DO2水平异常变化4发酵工业无菌技术早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关后期污染可能与③⑤及中间补料有关。耐热芽孢杆菌：与④有关球菌、无芽孢杆菌：与①②③⑤有关霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。①种子带菌②无菌空气带菌③设备渗漏④灭菌不彻底⑤操作失误污染原因分析时间杂菌种类染菌幅度4发酵工业无菌技术种子带菌的防治

灭菌彻底接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠保藏可靠过滤空气带菌的防治设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治预防124发酵工业无菌技术培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状：大颗粒的原料过筛除去。实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂防止泡沫升顶连消不彻底：最好采用自动控制装置灭菌后期罐压骤变死角

预防124发酵工业无菌技术法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”

——加强清洗并定期铲除污垢管路死角管道安装不当或配置不合理形成的“死角”

发酵罐的“死角”4发酵工业无菌技术发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”4发酵工业无菌技术法兰连接不当造成的“死角”4发酵工业无菌技术灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法4发酵工业无菌技术三、发酵工业的无菌技术方法干热灭菌法

湿热灭菌法

射线灭菌法

化学药剂灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法

4发酵工业无菌技术四、培养基及设备灭菌（一）湿热灭菌原理

（二）分批灭菌（实罐灭菌）（三）连续灭菌（连消）（四）分批灭菌与连续灭菌的比较（五）灭菌技术参数

4发酵工业无菌技术（一）湿热灭菌原理灭菌温度和时间的选择影响培养基灭菌的其它因素

4发酵工业无菌技术灭菌温度和时间的选择

随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌。4发酵工业无菌技术影响培养基灭菌的其它因素

培养基成分油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。4发酵工业无菌技术pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。培养基的物理状态泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂。培养基中的微生物数量4发酵工业无菌技术灭菌工艺过程分空气过滤器灭菌并用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽达70℃左右取样管放料管通蒸汽121℃，1×105pa保温保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水培养基降温到所需温度（二）分批灭菌（实罐灭菌）

4发酵工业无菌技术（三）连续灭菌（连消）工艺流程喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程4发酵工业无菌技术喷淋冷却连续灭菌流程4发酵工业无菌技术4发酵工业无菌技术（四）分批灭菌与连续灭菌的比较12

连续灭菌的优点：（适用于大型罐）可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小；可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。4发酵工业无菌技术缺点：对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；蒸汽波动时灭菌不彻底；当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。

（四）分批灭菌与连续灭菌的比较12

4发酵工业无菌技术五、空气除菌（一）概述（二）空气过滤除菌流程（三）空气预处理（四）空气过滤介质（五）空气过滤除菌原理（六）提高过滤除菌效率的措施4发酵工业无菌技术（一）概述空气除菌的必要性

以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86×105m3(50×0.7×0.8×170×60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。4发酵工业无菌技术空气除菌方法辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、β射线、γ射线、紫外线(2265Å~3287Å)加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量静电除菌：常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。

4发酵工业无菌技术4发酵工业无菌技术1.

对空气过滤除菌流程的要求流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条件综合考虑

环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件；在温暖潮湿的南方，要加强除水设施；压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染，也可采用无油润滑的往复式压缩机；通常要求压缩空气的相对湿度Φ=50%~60%时通过过滤器为好。4发酵工业无菌技术1.

对空气过滤除菌流程的要求流程主要设备：空气压缩机、空气过滤器

附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器

4发酵工业无菌技术2.

空气除菌流程的分析空气除菌系统包括：压缩、冷却、分离油水、加热、过滤几种典型的设备流程

两级冷却、加热除菌流程

冷热空气直接混合式空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程将空气冷却至露点以上的流程利用热空气加热冷空气流程一次冷却和析水的空气过滤流程

4发酵工业无菌技术（三）空气预处理1.

原理：除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤器寿命；降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水滴）加热：保持相对湿度稳压：防止压力波动，贮罐

2.

预处理流程设计的简繁关键：去湿问题措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器4发酵工业无菌技术

两级冷却、加热除菌流程图1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器；8-加热器；9-过滤器

4发酵工业无菌技术

冷热空气直接混合式空气除菌流程图1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4-冷却器；5-丝网分离器6-过滤器4发酵工业无菌技术

利用热空气加热冷空气的流程示意图1-高空采风；2-粗过滤器；3-压缩机；4-热交换器；5-冷却器；6，7-析水器；8-空气总过滤器；9-空气分过滤器4发酵工业无菌技术

将空气冷却至露点以上的流程1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5－冷却器；6－空气总过滤器；7－空气分过滤器4发酵工业无菌技术

高效前置过滤空气除菌流程图1—高效前置过滤器；2—压缩机；3—贮罐；4—冷却器；5—丝网分离器；6—加热器；7—过滤器4发酵工业无菌技术

一次冷却和析水的空气过滤流程示意图1－高空采风；2－粗过滤器；3－压缩机；4－冷却器；5，6—析水器；7—贮罐；8—加热器；9—空气总过滤器；10—空气分过滤器4发酵工业无菌技术空气压缩和压缩空气的冷却

空气的压缩过程可看作绝热过程，故压缩后的空气温度与被压缩的程度有关：

T2=T1(P2/P1)(k-1)/k

式中T1,T2——压缩前后空气的绝对温度，KP1,P2——

压缩前后空气的绝对压强，Pa