基层医院如何开展临床微生物检测

基层医院如何开展临床微生物检测襄阳市中心医院临床检验部微生物室邹玖明为什么要开展临床微生物检测？----必要性如何开展临床微生物检测？----软硬件设施建立！细菌鉴定基本知识及技能！有关抗菌药物敏感性实验的方法学！保证检验质量的准确性！----质量控制为什么要开展临床微生物检测？最重要的两个原因：不断增加的细菌耐药性！促进抗生素的合理使用！性文件卫医发〔2004〕285号:卫生部关于施行<抗菌药物临床应用指导原则>的通知卫办医发〔2006〕133号：卫生部办公厅关于进一步做好抗菌药物临床应用和细菌耐药监测工作的通知卫办医发〔〕48号:卫生部办公厅关于进一步加强抗菌药物临床应用管理的通知卫办医发〔〕130号:卫生部办公厅关于加强多重耐药菌医院感染控制工作的通知卫办医政发〔〕38号：卫生部办公厅关于抗菌药物临床应用管理有关问题的通知卫生部文件：

加强对抗菌药物临床应用的指导和监管

医疗机构要加强临床微生物检测与细菌耐药监测工作根据全国和本地区细菌耐药监测结果，结合本机构实际情况，建立、完善抗菌药物临床应用与细菌耐药预警机制，并采取相应的干预措施各级地方卫生行政部门要逐步建立、健全本辖区抗菌药物临床应用与细菌耐药监测管理体系开展对医疗机构抗菌药物临床应用的评价和指导抗生素的中国式滥用！

一个鲜明的对比：

医院抗菌药物年使用率

-----2006-2007年度卫生部全国细菌耐药监测★世界上没有哪个国家如此大规模地使用抗生素★74%中国22%~25%美英等发达国家VS＊中国的住院患者中抗生素的使用率高达70%，其中外科患者几乎人人都用抗生素，比例高达97%。如何开展临床微生物检测？软硬件设施建立：★人员素质★仪器设备★标准化的操作体系人员素质◆应该掌握临床微生物基本知识；◆掌握细菌鉴定及药敏试验基本操作技能；◆掌握常用培养基的配制；◆熟悉微生物检验室内质量控制规则。需配备的设施条件、仪器设备◆设施条件：符合生物安全的独立实验用房，分区设置合理（样本处理区、无菌区、转种区）。◆仪器设备：超净工作台（生物安全柜）、高压灭菌器、普通培养箱、CO2培养箱（烛缸）、冰箱、接种环、电热灭菌器（酒精灯）、光学显微镜等。需配备的设施条件、仪器设备◆试剂：接种标本用：哥伦比亚血平板、麦康凯平板、巧克力平板、真菌显色平板、淋球菌平板等；细菌鉴定用：氧化酶、触酶、靛基质、甲基红、VP、枸橼酸盐、氨基酸脱羧酶、胆汁七叶苷、6.5%NaCL等；药敏实验用：各种抗生素纸片、MH平板、HTM平板等；观察细菌形态用：革兰染液、抗酸染液。◆质控菌株：ATCC来源、室间质评来源。药敏质控必备的三个菌株：大肠埃希菌ATCC25922铜绿假单胞菌ATCC27853金黄色葡萄球菌ATCC25923

应该建立一套微生物检测的标准化操作体系，其参考资料可以来源于：《全国临床检验操作规程》、《试剂盒说明书》、定期更新的CLSI文件等。

体系内应该包含但不限于以下内容：各级检验人员的职责和权限实验室安全措施各类标本采集和处理方法细菌检验项目培养基和试剂的配制方法室内和室间质量控制

★操作体系应该每年进行一次评估，适时更新。标准化操作体系细菌鉴定基本知识细菌形态结构-----显微镜下观察菌落形态特征如何利用生化反应鉴定细菌细菌的形态

细菌主要有三种形态，即球形、杆形、螺形。据此将细菌分为三大类：球菌、杆菌、螺形菌。球菌1、双球菌如脑膜炎双球菌2、链球菌如乙型溶血性链球菌3、葡萄球菌如金黄色葡萄球菌脑膜炎奈瑟菌链球菌葡萄球菌杆菌单杆菌如大肠杆菌链杆菌如炭疽芽孢杆菌棒状杆菌如白喉棒状杆菌分枝杆菌如结核分枝杆菌球杆菌不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。炭疽芽胞杆菌3-10μm大中大肠埃希菌2-3μm小布鲁菌0.6-1.5μm杆菌的形态多样两端齐平炭疽芽胞杆菌两端尖细白喉棒状杆菌掌握细菌的镜下形态结构对于细菌鉴定很重要！某些特殊细菌的直接镜检报告对于临床疾病具有诊断意义！如：抗酸染色、分泌物涂片查革兰阴性双球菌。血液、脑脊液的阳性培养需要即时报告细菌的革兰染色结果，根据细菌的染色性、排列方式、形态可以初步区分种类。菌落的肉眼观察观察要点：菌落大小、颜色、溶血性、形态、表面光泽、湿润或干燥等。菌落大小：肠球菌、链球菌菌落小、肠杆菌科细菌菌落大（与培养时间、营养状态亦有关系）；颜色：PAE产绿色素、粘质沙雷菌菌落红色、SAU菌落金黄色；溶血性：α、β、γ溶血；形态：圆形、凸起、扁平、不规则锯齿形；表面光泽：PAE具有特殊的金属光泽；湿润/干燥：BCA菌落干燥易破碎、革兰阴性杆菌菌落湿润。

菌落形态大小与培养时间长短、培养基种类有关系；不同平板上相同的细菌具有不同的形态特征；不同的细菌在相同的平板上也可以菌落形态相似。细菌鉴定涂片镜检趋向性反应实验根据不同种属细菌选择生化反应根据主要的生化反应结果判定细菌种类商品化的鉴定试剂条、细菌鉴定仪涂片镜检：初步判断细菌革兰染色阴、阳性，球菌、杆菌、酵母菌等。革兰阳性

革兰阴性影响因素：涂片过厚将使脱色不完全，酒精脱色时间过长将导致过度脱色；染液储存过久由于蒸发而影响浓度，特别是碘液久存或见光而形成碘酸，失去媒染作用；95%酒精如果密封不佳易挥发，失去脱色作用；细菌形态学检查以对数生长期的细菌形态最为典型，菌龄过长易致阴性。趋向性生化反应氧化酶实验触酶实验阳性：紫红色阴性：无色阳性：大量气泡阴性或弱阳性：无或少量气泡大部分非发酵属细菌、弧菌属肠杆菌属、不动杆菌属、嗜麦芽寡养单胞菌葡萄球菌属链球菌属、肠球菌属氧化酶触酶（+）（-）（+）（-）有关抗菌药物敏感性实验的方法学！常用方法：K-B法、微量稀释法、E-test法；操作步骤注意事项纸片扩散法（Kirby-Bauer法）原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。操作方法：

1.将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm

的平板，其厚度4mm。

2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarland

No0.5管。4.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置3~10分钟后贴上标准抗生素纸片。6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。◆肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素；◆铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南；◆葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉素、环丙沙星、庆大霉素；且此记录便于实验室人员的查看，以便能随时解决发生的问题。有关抗菌药物敏感性实验的方法学！孵育，置平板于35℃孵育16～24h。肺炎链球菌对苯唑西林的抑菌环≥20mm的菌株对青霉素亦敏感(MIC≤0.金胺O染液结核分枝杆菌大肠埃希菌每次卫办医发〔2006〕133号：卫生部办公厅关于进一步做好抗菌药物临床应用和细菌耐药监测工作的通知肺炎链球菌对苯唑西林的抑菌环≥20mm的菌株对青霉素亦敏感(MIC≤0.棒状杆菌如白喉棒状杆菌±2℃培养基效期长短应参考实验室保存条件及权威参考书籍来制定。孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm

的平板，其厚度4mm。宣传一些特殊细菌的固有耐药知识。细菌形态学检查以对数生长期的细菌形态最为典型，菌龄过长易致阴性。◆熟悉微生物检验室内质量控制规则。不是所有的抗生素都需要做药敏实验，可以根据已报告的某种药物进行推定；±0.★需在透射光（Transmittedlight）下阅读万古霉素、利奈唑胺和苯唑西林的抑菌圈，遇不敏感的结果需用稀释法测定MIC法确证。◆肠球菌属：青霉素、万古霉素、四环素、高浓度庆大霉素、环丙沙星、氨苄西林；◆不动杆菌属：头孢他啶、亚胺培南、阿米卡星、头孢吡肟、米诺环素；◆洋葱伯克霍德菌：头孢他啶、米诺环素、甲氧苄啶/磺胺异噁唑；◆嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙星、米诺环素。7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。8.经过35℃16～24h孵育。9.取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该抗生素敏感(S)、耐药(R)、中介(I)。

E-TEST原理：

E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度，对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。操作方法：1.挑取16～20h的菌落2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置6条，9mm平板只能放置1～2试条。5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。如何来确定常规报告的抗菌药物种类？根据采用的方法学不同：K-B法、MIC法；

★不是所有种类细菌都能采用K-B法报告药敏结果；★不是所有细菌都有明确的折点判断标准。根据自己医院内使用的抗菌药物种类；由医院医务处、药学部、检验科微生物室共同商讨制定。结果报告的解释敏感是指分离菌株能被使用推荐剂量在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制。中介包括这些菌株，其抗菌药物MIC接近于血液和组织中通常可达到的水平，而抗微生物药治疗的反应率可能低于敏感株。“中介”分类意味着药物在生理浓集的部位具有临床效力(如尿液中的喹诺酮类和β-内酰胺类)或者可用高于正常剂量的药物进行治疗(如β-内酰胺类)。结果报告的解释耐药是指分离菌株不被常规剂量用药通常可达到的药物浓度所抑制，和/或证明抑菌环直径落在可存在某些特定的微生物耐药机制范围(如β-内酰胺酶)，并且治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠。关于药敏报告！不是所有的抗生素都需要做药敏实验，可以根据已报告的某种药物进行推定；3天之内的同患者同部位重复分离株可以不用重复进行药敏试验，但除这期间外的重复分离株必须再次测定。

举例：肺炎链球菌对苯唑西林的抑菌环≥20mm的菌株对青霉素亦敏感(MIC≤0.06μg/ml)，并经临床证实可以认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢布烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、厄他培南、亚胺培南、氯碳头孢和美洛培南敏感，所以不需要再测定这些药。随着用Ⅲ代头孢菌素治疗时间的延长，肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属可发展为耐药。最初分离的敏感菌株在开始治疗3~4天内可变为耐药，因此对重复分离菌株应重新进行药敏试验。在长期用抗生素治疗过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初次分离的敏感菌株在治疗3－4天后可能发生耐药。测试重复分离菌株可能是必要的。已经培养阳性的患者为何还要定期做重复的培养由铜绿假单胞菌引起的严重感染，青霉素类药物若敏感则需提高治疗剂量。对这种感染，用单一抗菌药物常致临床治疗失败，应考虑增加体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性的第2种药物（如氟喹诺酮类、氨基糖苷类）长期应用喹诺酮类治疗过程中，葡萄球菌属可发展其耐药性。因此，最初敏感的分离株在开始治疗3-4天后可以变为耐药，应对重复分离株测试药敏试验。已经培养阳性的患者为何还要定期做重复的培养正确阅读纸片法结果★完全抑制的抑菌圈直径，包括纸片的直径不反光的黑色背景、反射光下阅读结果；★抑菌圈的界限应该是以肉眼观察没有明显的可见细菌生长区域；★在抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌落应忽略。正确阅读抑菌圈内的“霾”现象★变形杆菌(迁移生长)以及磺胺类药物的纸片法药敏忽略薄纱样蔓延生长，微弱生长（20%或更少）；★克林霉素对葡萄球菌的抑菌圈内如有薄雾状菌苔应报告细菌对克林霉素耐药,不管其是否显示“D”抑菌圈；★需在透射光（Transmittedlight）下阅读万古霉素、利奈唑胺和苯唑西林的抑菌圈，遇不敏感的结果需用稀释法测定MIC法确证。需要检测MIC的细菌/药物肺炎链球菌

苯唑西林直径≤19mm,需要明确受试菌对青霉素的敏感性，必须做青霉素的E-试验革兰阳性球菌

万古霉素不敏感时（中介或耐药），必须测万古霉素的MIC确认受试菌对万古霉素的敏感性（包括替考拉宁、利奈唑胺等）草绿色链球菌

对青霉素、氨苄西林纸片法药敏结果不可靠，必须测MIC药敏试验中应注意的问题纸片扩散法★培养基标准化：pH、离子浓度、厚度、硬度、表面湿度★特殊培养基：HTM、5%羊血M-H★孵育条件：时间、温度、气体★接种菌量：0.5Mcfarland（麦氏标准管的保存及比浊仪的检定）★药敏纸片的效价、质量、保存、使用★结果判读：质控菌株保存（低温保存，避免反复传代）、卡尺检定★特殊耐药细菌的检测大部分非发酵属细菌、弧菌属纸片扩散法（Kirby-Bauer法）用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置6条，9mm平板只能放置1～2试条。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。在长期用抗生素治疗过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初次分离的敏感菌株在治疗3－4天后可能发生耐药。(90mm平皿+25ml培养基）氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、一代头孢菌素、头孢呋新、可立斯丁不断增加的细菌耐药性！细菌鉴定基本知识及技能！氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、一代头孢菌素、头孢呋新、可立斯丁◆应该掌握临床微生物基本知识；为什么要开展临床微生物检测？氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、一代头孢菌素、头孢呋新、应该定期的进行临床联系！正确的结果来源于正确的标本采集、转运、保存；一些特殊检验标本亦需床边采集。主动解释适时更新的药敏判断内容；医院定期组织对新进临床医技人员进行标本采集知识的培训；有必要向临床解释CLSI文件抗生素选择中“和/或”字的意义。宣传一些特殊细菌的固有耐药知识。菌属和菌种天然耐药全部肠杆菌科细菌糖肽类、大环内酯类、克林霉素、利萘唑胺、喹奴普丁、莫匹罗星鲍曼不动杆菌氨苄西林、阿莫西林、一代头孢菌素铜绿假单胞菌氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、一代、二代头孢菌素、头孢噻肟、头孢曲松、萘啶酸、甲氧嘧啶洋葱伯克霍尔德菌氨苄西林、阿莫西林、一代头孢菌素、可立斯丁、氨基糖苷类抗生素嗜麦芽窄食单胞菌全部单剂内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素黄杆菌属氨苄西林、阿莫西林、一代头孢菌素克雷伯菌属、变异枸橼酸菌氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、替卡西林肠杆菌属、弗劳地枸橼酸菌氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、一代头孢菌素、头孢西丁摩根摩根菌氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、一代头孢菌素、头孢呋新、普罗维登斯菌属氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、一代头孢菌素、头孢呋新、庆大霉素、萘替米星、妥布霉素、可立斯丁、呋喃妥因奇异变形杆菌可立斯丁、呋喃妥因普通变形杆菌氨苄西林、阿莫西林、头孢呋新、可立斯丁、呋喃妥因沙雷菌属氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、一代头孢菌素、头孢呋新、可立斯丁小肠结肠炎耶尔森菌氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、替卡西林、一代头孢菌素流感嗜血杆菌青霉素、红霉素、克林霉素卡他莫拉菌甲氧嘧啶全部革兰阳性菌氨曲南、可立斯丁、萘啶酸肺炎链球菌甲氧嘧啶、氨基糖苷类抗生素肠球菌除青霉素和氨苄西林外的青霉素类和头孢菌素类、低浓度氨基糖苷类李斯特菌三代头孢菌素、氟喹诺酮类保证检验结果的准确性人员素质高低；操作规范与否；室内质量控制不可少！仪器设备高压灭菌器：定期监测（至少每月一次）

生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌化学指示剂：变色的指示带（每批次高压物品）培养箱、冰箱、水浴箱：至少每日一次温度观测并记录厌氧培养装置（GENBAG）：

化学指示剂：美蓝生物学指标：PAECO2培养箱：

每天检查箱内的CO2浓度并记录生物安全柜：

定期更换滤网紫外线强度监测细菌培养仪：

厂家定期校正（每半年一次）培养瓶进行生长试验（更换新批次）微生物鉴定仪及时更新软件（很重要）每批次鉴定卡用标准菌株测定仪器设备的质量控制标准设备

控制标准

允许范围高压灭菌器121℃

≥121℃培养箱35℃

±1℃水浴箱37℃

±0.5℃冰箱4℃

±2℃低温冰箱-20℃

±5℃CO2培养箱5%~10%<10%培养基自制培养基配制记录：制作过程必须规范统一；培养基或添加剂的剂量、pH值、高温灭菌的时间或温度，均需遵照规定（制造商建议）；培养基名称、配制量、配方、配制日期和责任人都必须详细记录。成品培养基外观检查：

液体培养基应肉眼观察颜色、透明度，应澄清、无浑浊培养基的色泽异常应测pH值，不超过预期值的±0.2方可使用平板培养基易脱水，应保存于密封容器内或塑料袋内（两周左右），试管培养基可保存1-2个月无菌试验：

每批自制或成品培养基需进行无菌试验方法：随机选取5%~10%的量，如果配制大量的培养基，则任意选取10个培养基，35℃下过夜培养，证明无菌生长为合格。培养基量的要求：平板培养基的厚度一般为3mm

(90mm平皿+15~20ml培养基）药敏试验用为4mm

(90mm平皿+25ml培养基）斜面不超过试管的2/3性能验证：

每一批新制或新购的培养基，使用前均需进行标准菌株试验以鉴定是否能支持、区分或选择某类细菌的生长培养基的试验结果需要加以记录，项目包括试验日期、试验结果以及实验者的签名等。且此记录便于实验室人员的查看，以便能随时解决发生的问题。常用培养基的质量控制培养基标准菌株结果血平板

巧克力平板麦康凯平板

SS平板

化脓链球菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌大肠埃希菌福氏志贺菌奇异变形杆菌产气肠杆菌鼠伤寒沙门菌β溶血α溶血生长分解乳糖，菌落红色不分解乳糖，菌落无色透明不迁徙生长粉红色菌落无色菌落，中心黑色

培养基的有效期：培养基效期长短应参考实验室保存条件及权威参考书籍来制定。若购买成品培养基，应注意有效期的标示是否正确，如血平板的有效期为3星期，厌氧菌分离培养基为1-2星期等。

试剂、染色液及抗血清染液的质量控制染液要标明配制或购入日期，必须选用适当的标准菌株作阳性及阴性对照，以鉴定染色液的性能。革兰染色用ATCC25922和ATCC25923制备浓菌悬液，经高压灭菌后冰箱保存，作为革兰染色的质量控制，至少每周一次。各种染液的质控菌株染色液阳性对照菌阴性对照菌质控频度革兰染色液金黄色葡萄球菌大肠埃希菌每周抗酸染色液结核分枝杆菌大肠埃希菌每次金胺O染液结核分枝杆菌