蛋白质结构的分析

关于蛋白质结构的分析蛋白质的结构具有多种结构层次，包括一级结构和空间结构，空间结构又称为构象。空间结构包括二级结构、三级结构和四级结构。在二级与三级之间还存在超二级结构和结构域这两个结构层次。第2页,共46页，星期六，2024年，5月第3页,共46页，星期六，2024年，5月蛋白质分子构象的立体化学原则

（a）肽链空间构象的基本结构单位为肽平面或肽单位。所谓的肽平面是指肽链中从一个Cα原子到另一个Cα原子之间的结构，共包含6个原子（Cα、C、O、N、H、Cα），它们在空间共处于同一个平面。如下图所示：第4页,共46页，星期六，2024年，5月（b）肽键上的原子呈反式构型（c）肽键C-N键长为0.132nm,比一般的C—N单键（0.147nm）短，比C=N双键（0.128nm）要长，具有部分双键的性质（partialdouble-bondcharacter），不能旋转。而

Cα-COOH、C-NH2，为真正单键（puresinglebond），可以旋转。（d）相邻肽平面构成二面角：一个Cα原子相连的两个肽平面，由于N1—Cα和Cα—C2（羧基碳）两个键为单键，肽平面可以分别围绕这两个键旋转，从而构成不同的构象。一个肽平面围绕N1—Cα（氮原子与α—碳原子）旋转的角度，用Φ表示。第5页,共46页，星期六，2024年，5月

另一个肽平面围绕Cα—C2（α—碳原子与羧基碳）旋转的角度，用Ψ表示。这两个旋转角度叫二面角（dihedralangle）。通常二面角（Φ，Ψ）确定后，一个多肽链的二级结构就确定了。蛋白质空间结构要点：

a-螺旋（a-Helix）又称为3.613螺旋，Φ=-57。，Ψ=-47。结构要点：(1)多个肽键平面通过α－碳原子旋转，主链绕一条固定轴形成右手螺旋。(2)每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm。第6页,共46页，星期六，2024年，5月（3）相邻两圈螺旋之间借肽键中C＝O和N-H形成许多链内氢健，即每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C＝O之间形成氢键，这是稳定α－螺旋的主要键。（4）肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α－螺旋的形成。第7页,共46页，星期六，2024年，5月β-折叠（β-pleatedsheets）又称β—片层、β—结构，其结构要点如下：（1）多肽链呈锯齿状（或扇面状）排列成比较伸展的结构；（2）相邻两个氨基酸残基的轴心距离为0.35nm，侧链R基团交替地分布在片层平面的上下方，片层间有氢键相连；（3）有平行式和反平行式两种，平行式的折叠其Φ=–119。，Ψ=+113。。反平行折叠其Φ=–139。，Ψ=+135。

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蛋白质的三级结构：一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布，称为三级结构，是包括主、侧链在内的空间排列。大多数蛋白质的三级结构为球状或近似球状。在三级结构中，大多数的亲水的R侧基分布于球形结构的表面，而疏水的R侧基分布于球形结构的内部，形成疏水的核心。蛋白质的四级结构：

二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链（亚基），彼此借次级键相连，形成一定的空间结构，称为四级结构。

四级结构的实质是亚基在空间排列的方式。

第9页,共46页，星期六，2024年，5月第10页,共46页，星期六，2024年，5月蛋白质一级结构的测定

蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。测序要求

1样品必需纯（>97%以上）。

2知道蛋白质的分子量。

3知道蛋白质由几个亚基组成。

第11页,共46页，星期六，2024年，5月4测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。

5测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量

蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定

1肽链的拆开和分离。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理。

2测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

第12页,共46页，星期六，2024年，5月3二硫键的断裂，-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

4测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比第13页,共46页，星期六，2024年，5月5N端、C端的测定多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal)。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氢化锂法）。

6多肽链断裂可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

第14页,共46页，星期六，2024年，5月7测定每个肽段的氨基酸顺序。

8确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

9确定原多肽链中二硫键的位置一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。第15页,共46页，星期六，2024年，5月蛋白质结构分析的物理方法X射线衍射法

特征X射线及其衍射X射线是一种波长很短(约为20～0.06埃)的电磁波，能穿透一定厚度的物质，并能使荧光物质发光、照相乳胶感光、气体电离。在用高能电子束轰击金属“靶”材产生X射线，它具有与靶中元素相对应的特定波长，称为特征（或标识）X射线。如通常使用的靶材对应的X射线的波长大约为1.5406埃。1埃=0.1纳米=10-10m第16页,共46页，星期六，2024年，5月

考虑到X射线的波长和晶体内部原子面间的距离相近，1912年德国物理学家劳厄提出一个重要的科学预见：晶体可以作为X射线的空间衍射光栅,即当一束X射线通过晶体时将发生衍射，衍射波叠加的结果使射线的强度在某些方向上加强，在其他方向上减弱。分析在照相底片上得到的衍射花样，便可确定晶体结构。1913年英国物理学家布拉格父子在劳厄发现的基础上,不仅成功地测定了NaCl、KCl等的晶体结构,并提出了作为晶体衍射基础的著名公式──布拉格方程：2dsinθ=nλ

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当X射线以掠角θ(入射角的余角)入射到某一点阵晶格间距为d的晶面上时，在符合上式的条件下，将在反射方向上得到因叠加而加强的衍射线。布拉格方程简洁直观地表达了衍射所必须满足的条件。当X射线波长λ已知时(选用固定波长的特征X射线)，采用细粉末或细粒多晶体的线状样品,可从一堆任意取向的晶体中，从每一θ角符合布拉格方程条件的反射面得到反射,测出θ后，利用布拉格方程即可确定点阵晶面间距、晶胞大小和类型;根据衍射线的强度,还可进一步确定晶胞内原子的排布。第18页,共46页，星期六，2024年，5月第19页,共46页，星期六，2024年，5月X-ray对蛋白结构的测定1.晶体培养结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的关键步骤，是蛋白质晶体结构分析的瓶颈。蛋白质结晶过程是一个有序化的过程。一般可分为两个阶段：首先是在一定的沉淀剂浓度下，让蛋白质溶液以适当高的浓度达到过饱和状态，蛋白质分子从溶液中析出并聚集形成晶核；然后是周围的分子向晶核聚集，晶体逐渐长大。第20页,共46页，星期六，2024年，5月

由于蛋白质结晶比小分子结晶要复杂，这是由于大分子分子量很高，几何形状较复杂，表面电荷多种多样，因此在外界条件的影响下，分子构象容易产生某些变化，一些小分子结晶的方法都不适用于大分子，使得大分子结晶工作相当困难。蛋白质结晶的方法：常用的结晶方法是气相扩散法。第21页,共46页，星期六，2024年，5月

微量蒸气扩散法主要是通过在一个封闭体系内，在能使某种蛋白质结晶的较高沉淀剂浓度的溶液与含有较低沉淀剂浓度的蛋白质溶液之间发生蒸汽扩散，最后两者达到平衡，蛋白质溶液内沉淀剂浓度逐渐增加使得蛋白质的溶解性降低，达到过饱和析出而结晶。第22页,共46页，星期六，2024年，5月

蛋白质结晶经过了长期的摸索，已形成商品化的试剂盒，如HamptonResearch公司的CrystalScreenKits。第23页,共46页，星期六，2024年，5月

2．数据收集和处理。一般来讲，中等大小晶胞的一套高分辨率数据，至少要收集几万个衍射强度数据，在经过专门的数据处理程序包处理，给出这一套数据的各种统计结果，以判断数据质量的好坏。第24页,共46页，星期六，2024年，5月3.测定相位分子置换法，单/多对同晶置换法（SIR/MIR），单/多波长反常散射（SAD/MAD）等。同晶置换法和反常散射法都需要在蛋白质结构中通过实验的方法引入重原子，所以由其所得的相位称为实验相位，它们是求解新结构的主要方法。而分子置换法可以解析有同源结构的未知结构。

4.相位的改进。电子密度图的质量及其后的可解释性主要决定于相角的准确性。在某些情况下采用晶胞不对称单元中等同部分的电子密度平均，有可能大大改善误差较大的起始相角。第25页,共46页，星期六，2024年，5月5.电子密度图的计算和解释。有了每个衍射点的相位，加上已经收集到的每个衍射点的结构振幅，就可计算电子密度图。由于蛋白质分子结构的复杂性，它的电子密度图随着分辨率的不同，从图上能识别出的结构层次也不同。

6.结构模型修正。从电子密度图上最初建立的蛋白质分子结构模型是比较粗糙的，需要进一步精华。第26页,共46页，星期六，2024年，5月第27页,共46页，星期六，2024年，5月二.核磁共振

核磁共振（NuclearMagneticResonance即NMR）是处于静磁场中的原子核在另一交变磁场作用下发生的物理现象。并不是是所有原子核都能产生这种现象，原子核能产生核磁共振现象是因为具有核自旋。原子核自旋产生磁矩，当核磁矩处于静止外磁场中时产生能级分裂。在交变磁场作用下，自旋核会吸收特定频率的电磁波，从较低的能级跃迁到较高能级。这种过程就是核磁共振。第28页,共46页，星期六，2024年，5月

NMR技术即核磁共振谱技术，是将核磁共振现象应用于分子结构测定的一项技术。对于孤立原子核而言，同一种原子核在同样强度的外磁场中，只对某一特定频率的射频场敏感。但是处于分子结构中的原子核，由于分子中电子云分布等因素的影响，实际感受到的外磁场强度往往会发生一定程度的变化，而且处于分子结构中不同位置的原子核，所感受到的外加磁场的强度也各不相同，这种分子中电子云对外加磁场强度的影响，会导致分子中不同位置原子核对不同频率的射频场敏感，从而导致核磁共振信号的差异，这种差异便是通过核磁共振解析分子结构的基础。第29页,共46页，星期六，2024年，5月

原子核附近化学键和电子云的分布状况称为该原子核的化学环境，由于化学环境影响导致的核磁共振信号频率位置的变化称为该原子核的化学位移。耦合常数是化学位移之外核磁共振谱提供的的另一个重要信息，所谓耦合指的是临近原子核自旋角动量的相互影响，这种原子核自旋角动量的相互作用会改变原子核自旋在外磁场中进动的能级分布状况，造成能级的裂分，进而造成NMR谱图中的信号峰形状发生变化，通过解析这些峰形的变化，可以推测出分子结构中各原子之间的连接关系。第30页,共46页，星期六，2024年，5月

信号强度是核磁共振谱的第三个重要信息，处于相同化学环境的原子核在核磁共振谱中会显示为同一个信号峰，通过解析信号峰的强度可以获知这些原子核的数量，从而为分子结构的解析提供重要信息。表征信号峰强度的是信号峰的曲线下面积积分。另一个重要信息是NOE效应，当分子内有在空间位置上互相靠近的两个核A和B时，如果用双共振法照射A，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的质子B的共振信号就会增加，这种现象称NOE。第31页,共46页，星期六，2024年，5月

产生这一现象的原因是由于二个核的空间位置很靠近，相互弛豫较强，当A受到照射达饱和时，它要把能量转移给B，于是B吸收的能量增多，共振信号增大。这一效应的大小与核间距离的六次方成反比。第32页,共46页，星期六，2024年，5月NMR对蛋白结构的测定

要测定大分子物质就需要利用二维核磁共振以及多维核磁共振。一维核磁共振是在一个脉冲之后的t1时间进行数据收集，二维核磁共振在t1时间后再加一个脉冲后在t2时间内收集数据S（t1，t2），然后分别以t2和t1为变量进行傅立叶变换就得到二维谱S（w1，w2）。二维谱就是把作为对角线的一维谱的峰进一步分开。第33页,共46页，星期六，2024年，5月

在生物学研究中最常用的是两种谱：相关谱（correlatedspectroscopy，COSY）和增强谱（NuclearOverhauserEnhancementSpectroscopy，NOESY）。COSY也有显示J偶合的同核位移相关谱和异核自旋－自旋偶合。如果已知蛋白质的一级结构中氨基酸残基的连接顺序，则通过COSY谱可以很容易地辨认出每个峰的归属。而NOESY谱是指两个没有自旋自旋耦合的核，若在空间距离上小于0.5nm时，辐照其中一个核使之饱和，另一个核的信号强度会增强而产生交叉峰。这种交叉峰地面积大小与两核间距的六次方成反比。因此可以利用这两种谱，第一步COSY谱指认出产生共振峰的核，第二步是从J偶合和NOESY谱确定的NOE值确定出二级结构的类型以及核间距离，根据核间距离构建出三级结构的模型。第34页,共46页，星期六，2024年，5月三.红外光谱和拉曼光谱

分子红外光谱是由分子不停地作振动和转动而产生的。分子振动是指分子中各原子在平衡位置附近作相对运动，多原子分子可组成多种振动模式。含N个原子的分子应有3N－6个简正振动方式；如果是线性分子，只有3N－5个简正振动方式。图中示出非线性3原子分子仅有的3种简正振动模式。分子的转动指的是分子绕质心进行的运动。分子振动和转动的能量不是连续的，而是量子化的。当分子由一种振动（或转动）状态跃迁至另一种振动（或转动）状态时，就要吸收或发射与其能级差相应的光。第35页,共46页，星期六，2024年，5月

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拉曼光谱指：当光穿过透明介质被分子散射的光发生频率变化，这一现象称为拉曼散射。在透明介质的散射光谱中，频率与入射光频率相同的成分称为瑞利散射；频率对称分布在两侧的谱线或谱带即为拉曼光谱，其中频率较小的成分又称为斯托克斯线，频率较大的成分又称为反斯托克斯线。拉曼光谱的理论解释是，入射光子与分子发生非弹性散射，分子吸收频率为υ0的光子，发射υ0－υ1的光子，同时分子从低能态跃迁到高能态（斯托克斯线）；分子吸收频率为υ0的光子，发射υ0＋υ1的光子，同时分子从高能态跃迁到低能态（反斯托克斯线)。第37页,共46页，星期六，2024年，5月偶极矩与极化度：分子偶极矩可由键偶极矩经矢量加法后得到（这里只涉及分子）。若将极性分子置于均匀的外电场中，分子将沿电场方向转动，同时还会发生电子云对分子骨架的相对移动和分子骨架的变形，称为极化。红外光谱和拉曼光谱主要在外表上的区别就用“偶极矩与极化度”来解释。

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红外光谱和拉曼光谱对蛋白结构的测定傅里叶变换-IR测量蛋白中功能基团和高极性键的振动。在其对蛋白二级结构测定中，最受关注的是酰胺基团中C=O键伸展的结构，同时伴随着N-HC-N键的伸展，对氢键和二级结构敏感。拉曼光谱常用于金属蛋白，其生色团的电子跃迁配合金属中心产生了更加强劲的基本拉曼效应。配基的振动模式被急剧加强，这对鉴定蛋白金属中心的结构组织相当有用。第39页,共46页，星期六，2024年，5月四旋光光谱和圆二色光谱

旋光光谱：许多物质具有旋光性（又称光学活性），如含有手性碳原子的有机化合物。当平面偏振光通过这些物质（液体或溶液）时，偏振光的振动平面向左或向右旋转，这种现象称为旋光。偏振光旋转的角度称为旋光度。平面偏振光可分解为振幅、频率相同,旋转方向相反