DB54T-青稞中燕麦镰刀菌LAMP检测技术规范

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h\t"标准文件_一级条标题,2,标准文件_附录一级条标题,2,"前言 II1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14方法原理 15试剂和材料 16仪器和设备 27测定步骤 28结果判定 3前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：本文件主要起草人：青稞中燕麦镰刀菌LAMP检测技术规范范围本文件规定了青稞中燕麦镰刀菌LAMP检测方法的方法原理、试剂和材料、仪器和设备、测定步骤和结果判定。本文件适用于青稞中燕麦镰刀菌的检测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB27403实验室质量控制规范视频分子生物学检测术语和定义请选择适当的引导语环介导等温扩增技术Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP在等温（60℃~65℃）条件下，利用链置换DNA聚合酶，60min内实现脱氧核糖核酸扩增的技术。方法原理扩增原理根据燕麦镰刀菌的翻译延伸因子序列中特异性序列设计特异性内、外引物一组，引物特异性性识别目标序列上的六个独立区域，利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，在同一链上互补序列周而复始形成很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。SYBRGreenI染料显色原理SYBRGreenI是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA双螺旋小沟区域内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1000倍。在不发生扩增反应时，SYBRGreenI荧光信号很弱，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBRGreenI的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度与双链DNA分子的数量相关，同时颜色由橙色变为绿色。试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。引物：根据燕麦镰刀菌DNA的翻译延伸因子序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1、外引物2和内引物1、内引物2。外引物（F3，5’~3’）1：GTGATACCACGCTCACGC外引物（B3，5’~3’）2：GGTATCTTACCCCGCCACT内引物（FIP，5’~3’）1：AATAGGAAGCCGCCGAGCTCTGAGCTTGTCAAGAACCCAG内引物（BIP，5’~3’）2：TGGCTGCAAGACATAGTGCGCGATGCGCTTGCCCTGTTC等温扩增PCR混合液（2×LAMPPCRMasterMix)本产品购置于生工生物（上海）股份有限公司。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。)）:包含0mmol/LTris~HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/LKCl（pH8.8）、16mmol/LMgSO4、2.0mmol/LdNTPs、0.2%TrionX~100)本产品购置于生工生物（上海）股份有限公司。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。DNA快速提取试剂：DNA~EZReagentsAll~DNA~Fast~Out)本产品购置于生工生物（上海）股份有限公司。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。))本产品购置于生工生物（上海）股份有限公司。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL甜菜碱：5mol/L。显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000×。离心管:1.5mL。塑料研磨棒：长度70cm，研磨头外径6.2mm，研磨头长度9.5mm。吸头：配套可调移液器使用。仪器和设备可调移液器：1μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL水浴锅或加热模块（62℃±1℃、80℃±1℃和100℃±1℃）.计时器。测定步骤试验设置阴性对照：采用不含有目标基因序列的燕麦镰刀菌基因组DNA为模板。阳性对照：采用含有目标基因序列的燕麦镰刀菌基因组DNA为模板。空白对照：以水代替DNA模板。试样采集进行田间青稞中燕麦镰刀菌快速检测时，切取0.5cm×0.5cm待检测的青稞籽粒样品，放置于1.5mL离心管中保存并标记。试样DNA提取将100μL的DNA快速提取液加入到盛有试样的1.5mL离心管，用研磨棒研磨5min。100℃±1℃加热5min。用手震荡混匀后取裂解物直接进行LAMP反应。LAMP反应步骤反应体系LAMP反应体系见表1。每个试样各做2个平行管，加样时使试样DNA溶液完全加入反应液。在反应体系配置完成后，将1μL显色液滴于反应罐的管盖内测。LAMP反应体系组分工作液浓度加入量（μL）外引物（F3）110μmol/L0.6外引物（B3）210μmol/L0.6内引物（FIP）140μmol/L0.6内引物（BIP）240μmol/L0.6等温扩增PCR混合液2×12.5甜菜碱4mol/L1.6BstDNA聚合酶8U/μL0.5DNA模板~1水~3反应过程62℃±1℃恒温扩增40min，80℃±1℃持续10min，反应结束。显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒混匀，立即在正常光照于黑色背景下进行颜色观察。阴性对照：反应管中液体呈橙色。阳性对照：反应管中液体呈绿色。空白对照：反应管中液体呈橙色。生物安全和防污染措施实验室生物安全应符合GB19489的规定。环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403中附录D规定。结果判定待测样品2个