GB∕ T 31402-2023 塑料和其他无孔材料表面抗菌活性的测定（正式版）

GB/T31402—2023代替GB/T31402—2015(ISO22196:2011,IDT)国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会GB/T31402—2023 I 2规范性引用文件 13术语和定义 24.1试验细菌 2 2 46仪器灭菌和菌种保藏 46.1干热灭菌 46.2高压蒸汽灭菌 46.3玻璃器皿的准备 46.4菌种的保藏 5 57.1细菌预培养 57.2试样的制备 57.3接种液的制备 57.4试样接种 57.5接种试样的培养 67.6试样上的细菌回收 77.7平板培养法测定活菌数 7 78.1活菌数测定 78.2试验有效的条件 88.3抗菌活性值的计算 88.4抗菌效果 89重复性与再现性 810试验报告 8附录A(规范性)生物材料的质量要求 附录B(资料性)重复性和再现性 附录NA(资料性)抗菌率的计算 GB/T31402—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替GB/T31402—2015《塑料塑料表面抗菌性能试验方法》,与GB/T31402—2015相和产品的描述(见第1章，2015年版的第1章);c)更改了“试样的制备”中清洗试样的要求(见7本文件做了下列最小限度的编辑性改动：-—用资料性引用文件GB/T19275—2003中的方法B替换了ISO846:1997中的方法C,两个文件相关技术内容完全一致(见第1章);——表1中列出了与测试菌种等同的国内菌株号，并以脚注的形式加以说明；请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国石油和化学工业联合会提出。本文件由全国塑料标准化技术委员会(SAC/TC15)归口。本文件于2015年首次发布，本次为第一次修订。IⅡGB/T31402—2023抗菌材料和产品因其全新的功能已被消费者广泛而迅速地认可，该功能与传统的材料保护功能具GB/T31402—2015的适用范围主要为塑料表面。本文件适用范围已扩展到由其他无孔材料制成的产品表面，适用于上述各类产品。基于J1GB/T31402—2023塑料和其他无孔材料表面抗菌活性的测定本文件不涉及光催化材料及产品(ISO274478)适用)。试验结果宜包括对本文件的引用和试验条件。利用本文件所得结果表明，在本文件规定的试验条试验需要把最小剂量的抗菌剂(化学品)溶入到接种菌液中。建议试验人员按照ISO7218进行微生物检验操作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。ISO7218食品和动物饲料的微生物学微生物检验的一般要求和指南(Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Generalrequirementsandguidanceformicrobiologicalexaminations)3术语和定义3.13.23.3产品表面抑制细菌生长的性能或抗菌剂抑制产品表面细菌生长的效果。通过表面抗菌处理或添加到产品而抑制细菌在产品表面生长的药剂。抗菌活性值antibacterialactivi2GB/T31402—20233.44材料应使用以下两种细菌：a)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);b)大肠杆菌(Escherichiacoli)。试验所用菌株如表1所示。如从表1以外的机构获取菌株，则该机构应是世界菌种保藏联合会菌种名称菌株金黄色葡萄球菌ATCC6538P(CGMCC1.2910*)CIP53.156DSM346NCIB8625大肠杆菌ATCC8739(CGMCC1.2463°)CIP53.126NBRC3972NCIB8545中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)是WFCC成员，与金黄色葡萄球菌ATCC6538P等同的国内菌株号为CGMCC1.2910,与大肠杆菌ATCC8739等同的国内菌株号为CGMCC1.2463。所有试剂应为分析纯和/或适用微生物试验用的级别。非离子表面活性剂应为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。所需生物材料如下：——卵磷脂；3GB/T31402—20234.2.3.2悬浮培养基——1/500营养肉汤(1/500NB)离子水稀释至500倍体积，并用氢氧化钠溶液或盐酸将pH值调整至6.8～7.2。用高压蒸汽灭菌(见6.2)。如不立即使用，置于5℃~10℃条件下保藏。不应使用存放7d或以上的1/500NB。在电炉上或沸水水浴箱中加热，搅拌直至琼脂溶解。用氢氧化钠溶液或盐酸将pH值调整至7.0～7.2(25℃)。用高压蒸汽灭菌(见6.2),如不立即使用，置于5℃~10℃条件下保藏。不应使用存放30d或以上的营养琼脂。中。在电炉上或沸水水浴箱中加热，搅拌直到琼脂溶解。用氢氧化钠溶液或盐酸将pH值调整至7.0~7.2(25℃)。用高压蒸汽灭菌(见6.2)。如不立即使用，置于5℃~10℃条件下保藏。不应使用存放30d或以上的平板计数琼脂。将6mL～10mL加热溶解的营养琼脂倒入螺盖试管中，用高压蒸汽灭菌(见6.2)。灭菌后将试管与水平方向呈15°左右的角度放置，让培养基凝固。如不立即使用，置于5℃~10℃条件下保藏。不应使用存放30d或以上的斜面培养基。脂溶入1000mL蒸馏水或去离子水中，搅拌均匀后加入7.0g非离子表面活性剂，用氢氧化钠溶液或盐酸将pH值调整至6.8～7.2(25℃),高压蒸汽灭菌(见6.2)。如不立即使用，置于5℃~10℃条件下保藏。不应使用存放30d或以上的SCDLP培养液。氧化钠溶液调整pH至6.8～7.2(25℃)。加入去离子水或蒸馏水至1000mL。高压蒸汽灭菌(见4GB/T31402—20236.2)。不应使用存放30d或以上的磷酸盐缓冲液。4.2.3.8磷酸盐缓冲生理盐水将8.5g氯化钠加入1000mL去离子水或蒸馏水中，搅拌均匀，制备生理盐水。以生理盐水稀释磷酸盐缓冲液(4.2.3.7)至800倍体积。高压蒸汽灭菌(见6.2)。如不立即使用，置于5℃~10℃条件下保藏。不应使用存放30d或以上的磷酸盐缓冲生理盐水。如无特别说明，使用以下器具和材料。5.1干热灭菌器：温度保持在160℃~180℃,温度波动不超过±2℃。5.2高压蒸汽灭菌锅：温度保持在121℃±2℃,压力保持在103kPa±5kPa。5.3带搅拌的加热电炉或水浴箱。5.5天平：精度±0.01g。5.6移液器：带有1000μL的吸头，灭菌后使用。5.7培养箱：在设定温度下，温度波动不超过±1℃。5.8漩涡搅拌器：若需使用(见7.6.1)。5.9超声波清洗器：若需使用(见7.6.1)。5.10接种环：直径4mm,灭菌后使用。5.11覆盖膜：不影响细菌生长并且不吸水(以聚乙烯、聚丙烯或聚对苯二甲酸乙二醇酯制成等)。膜厚度宜在0.05mm～0.10mm之间。5.12带螺盖试管。5.13培养皿：直径90mm～100mm,灭菌后使用。5.14纱布或脱脂棉。5.151000mL容量瓶。5.16制备培养基所需要的具塞锥形瓶或培养基瓶。6仪器灭菌和菌种保藏6.1干热灭菌将物品放入干热灭菌器，灭菌温度和时间如下：温度灭菌时间30min60min6.2高压蒸汽灭菌将物品放入高压蒸汽灭菌锅，于121℃±2℃灭菌15min或以上。6.3玻璃器皿的准备用碱性或中性清洁剂清洗，然后用蒸馏水或去离子水冲洗干净。使用前用干热灭菌器或高压蒸汽5GB/T31402—2023菌种接种于适当的培养基上，应存放在5℃~10℃条件下，每30d转种一次。不应使用转种超过7试验步骤用无菌接种环将细菌从保藏菌种的培养基上转移到斜面培养基(4.2.3.5)上并于35℃±1℃培养16h～24h。再将培养好的细菌用无菌接种环转至新鲜的斜面培养基，于35℃±1℃培养16h～20h。每种经过抗菌处理的材料应至少准备3片试样，未经抗菌处理的材料至少准备6片。3片未经抗菌处理试样用于接种后立即测量活的细菌数，另3片用于测量接种后24h的活细菌数。在对同一聚合材料的一系列抗菌处理的样品检测时，若所有抗菌样品都采用同一个菌液同时进行制备抗菌处理和未经抗菌处理的试样，试样尺寸为(50±2)mm×(50±2)mm,试样厚度不宜超过10mm。如果无法切割成规定尺寸的试样，可采用其他尺寸和形状，只要试样能够被面积为(400~1600)mm²的覆盖膜覆盖即可。优先考虑从产品上制备测试样，如果无法从制品上制备上述尺寸的试样，可利用相同原料和工艺以适宜测试的尺寸单独制备试样。如果试样尺寸不是50mm×50mm,则应在试验报告中写明实际的试样尺寸。止交叉污染，应确保该金属无抗菌效果。必要时，能在试验前对试样进行清洗、消毒或杀菌(如以70%酒精擦洗)。使用无菌接种环，转移一环预培养好的细菌(见7.1)到少量的1/500NB(4.2.3.2)中。确保细菌分散均匀，并采用显微镜观测及细胞计数板或利用其他合适的方法(如分光光度计法)测定细菌数量。用1/500NB稀释菌悬液，使细菌的浓度在2.5×10⁵cells/mL～10×10⁵cells/mL之间，最适浓度为6.0×10⁵cells/mL,用作接种液。如果接种液不立即使用，将其放置于冰块上(0℃)并在2h内使用。产品的暴露面作为测试表面，不应测试产品的横切面。将各个试样(见7盖膜边缘渗出。在试样接种完并盖上覆盖膜后，盖上培养皿盖(见图1)。6GB/T31402—2023标引序号说明：3——试样；4——培养皿； 单位为毫米除非特别说明，覆盖膜的标准尺寸应为正方形(40±2)mm×(40±2)mm,而试样尺寸为50mm×不应小于400mm²,并且覆盖膜边缘距试样边缘应为2.5mm～5.0mm。如果覆盖膜的尺寸不是40mm×40mm,应在试验报告中说明其实际尺寸。所使用的接种液体积也应按覆盖膜面积变化的比接种液不应从覆盖膜边缘渗出。然而，很难防止菌液从某些表面(如亲水性非常强的表面)渗出。采用下面的选项1防止菌液渗出。如果采用选项1仍发生渗出，则选用选项2。如果采用其中一个选——选项1:减少菌液体积以适应试样表面，但菌液体积不应小于0.1mL。当菌液体积减少时，应——选项2:通过增加惰性增稠剂(如琼脂)以增加接种液的黏度。除特别说明外，含有接种试样(包括3片未经抗菌处理产品的接种试样)的培养皿，在(35±1)℃相对湿度不小于90%的条件下培养(24±1)h。根据在培养温度下检测所得到的抗菌活性值来确定产品的抗菌效果。在相关方同意的条件下，也可采用其他培养温度。如使用的不是(35±1)℃,应在试验报告中记录。7GB/T31402—2023注：若培养温度低于35℃,活菌总数将会减少。这将使所测得的抗菌活性值与35℃下所测得的结果不同。接种后，立即对已接种的3片未经抗菌处理试样进行菌种回收，在这3个培养皿中分别加入10mLSCDLP培养液(4.2.3.6)或其他适宜而有效的中和剂。从未经抗菌处理试样获得的菌数将用于确定细菌的回收率。确保试样得到充分冲洗，即用移液管吸取和释放SCDLP特别注意的是，需要达到足够的接种菌的回收率。尤其是如试验中采用了7.4中的选项2,导致菌冲洗法，则可采用上述方法。若变更回收方法，则应在试验报告中说明。由于试样的尺寸和性质的原7.7平板培养法测定活菌数用磷酸盐缓冲生理盐水(4.2.3.8)对SCDLP回收液进行10倍梯度稀释，以计算活菌。将试样上的回收液及其10倍稀释液各取1mL,分别放入无菌培养皿中，每个稀释度应做两个培养皿。每个培养皿养40h～48h。培养后，对培养皿中菌落数在30～300之间的菌落进行计数。记下每个稀释度培养皿上的菌落数并保留两位有效数字，记录稀释倍数。若1mL洗脱液中的细菌数小于30,则对该培养皿直接计数。如8试验结果N=(100×C×D×V)/A…………(1)式中：N——每个试样每平方厘米的活菌数；D——稀释倍数；V——用于洗脱的SCDLP培养液的体积，单位为毫升(mL);计算每组试样回收活菌数的算术平均值并记录，取两位有效数字。若各稀释度的所有琼脂板上都没有菌落，则将菌落数计作<V(用于洗脱的SCDLP培养液的体积)。计算平均值时，如各稀释度均没8GB/T31402—20238.2.2未经抗菌处理试样接种后立即测得的细菌数的对数值应符合公式(2)要求：(LmaxLmin)/Lmean式中：Lmin——试样上最小活菌数的常用对数；8.2.3未经抗菌处理的试样接种后立即测得的活菌平均值应在6.2×10³cells/cm²~2.5×10⁴cells/cm²。8.2.4每个未经抗菌处理试样接种后培养24h活菌数不应小于62cells/cm²式中：R——抗菌活性值；U₀——未经抗菌处理试样接种后立即回收的活菌数的常用对数的平均值，菌数单位为细菌数每平方厘米(cells/cm²);U₁——经抗菌处理试样接种24h回收活菌数的常用对数的平均值，菌数单位为细菌数每平方厘米(cells/cm²):A.——经抗菌处理试样接种24h的菌数的常用对数的平均值，菌数单位为细菌数每平方厘米(cells/cm²)。抗菌活性值能用于表征抗菌效果。判定抗菌效果的抗菌活性值指标应由相关方商定。9重复性与再现性对重复性和再现性进行了定量讨论(见附录B)。a)注明采用本文件编号；e)接种菌液的体积；f)计算得到的接种菌液的活菌数；9GB/T31402—2023h)计算所得的抗菌活性值；k)试验日期；GB/T31402—2023(规范性)生物材料的质量要求A.1概述根据来源的不同，用于接种液制备的材料的质量会有所差异，从而对结果产生重大影响，因而其成分需专门规范。A.21/500营养肉汤(1/500NB)的化学成分牛肉膏和蛋白胨是控制1/500营养肉汤质量差异的关键成分。以下是本文件对市售材料中总氮和牛肉膏蛋白陈(酪蛋白的酶消解产物)总氮12.0%～16.0%GB/T31402—2023(资料性)重复性和再现性B.1背景本附录内容是基于大量研究结果所获得的本方法的重复性和再现性。该研究于2000年至2004年由日本国家技术与评价研究所完成，其目的一方面是采纳ISO/IEC17025[6]作为实验室认可体系(见参考文献[12])的一部分，另一方面是测定JISZ280111的不确定度，该方法是本文件制定的依据。B.2概述通过统计分析确定了本方法的重复性和再现性(见ISO5725-2[2)。对两种经处理过的测试样品在5个实验室进行，从而得出抗菌活性的试验结果。在剔除其中一个实验室的数据后，根据剩余实验室的同一实验室的相同测试项目重复性为0.087;不同实验室相同测试项目的再现性为0.304。这些数据是用本方法能获得的重复性和再现性的举例，不宜用于判定是否认可不同实验室的测试结果。B.3试验实验室间测试所用的材料和应用的试验条件见表B.1。表B.1材料与试验条件抗菌处理的试样PET膜，50mm×50mm方块，厚度0.055mmI类试样：丙烯酸(树脂)涂层，混合350pg/g银化合物Ⅱ类试样：丙烯酸(树脂)涂层，混合450μg/g银化合物未经抗菌处理对照试样PET膜，50mm×50mm方块，厚度0.055mm,但涂层中不加银化合物覆盖膜PE膜，40mm×40mm方块，厚度0.09mm菌种金黄色葡萄球菌NBRC12732(见注)接种菌液体积注：仅使用金黄色葡萄球菌，是因为它比大肠杆菌具有更高的变异性。参加实验室间测试的5个实验室都对两种样品进行了重复的测试。用于各个阶段的样品数均符合样品包含涂了水溶性丙烯酸树脂涂层的PET膜。在涂丙烯酸树脂前混入一定量的银系抗菌剂，以确保试验样品上的抗菌剂均匀分布。由于丙烯酸涂层是水溶性的，接种菌液容易扩散到涂层以外的区域。样品/膜的结构与本文件的样品有所不同，所以，先在覆盖膜上有时，空白对照膜和未经处理的材料(质量分数为0)上的细菌存活率存在很大差异。有可能无法制备真正的空白材料，因为添加剂不是材料的组成部分，就是材料的载体，相关的未处理体系将是无涂层的基材，而不是没有添加剂的基材。因此，在某些情况下，宜与标准材料进GB/T31402—2023经初步分析，采用裂区分析计算得到一个实验室的Z值大于2.0,因此，该实验室的数据结果被弃用，数据分析仅采用剩余4个实验室的测试结果。表B.2列出了抗菌性能的平均值和每种抗菌处理试样的标准差。重复性试验显示为下表第一组和第二组。样品种类(见表B.1)平均抗菌活性值(括号内为标准差)第一组第二组I类试样Ⅱ类试样每个实验室对两种类型样品均做了2次重复实验。每种类型样品采用3个相同的试样。考虑分析结果的变异性来源包括重复试验变异性Vk(即结果或来自第一组或来自第二组),实验室间变异性VL和3种被测试样之间的变异性Vs。因为Vr和VL不能随机化，每组都要单独分析。表B.3列出了方差表B.3方差分析表与不确定度变异性来源平方和自由度平方平均值F(检验)重复，VR1实验室，VL3Vr×V₁(一阶误差，e₁)3测试样品，Vs1313二阶误差，e₂总计如表B.3所示，主要区组误差VR×V₁(一阶误差e₁)比二阶误差e₂在1%水平时差异性更显著。另一方面，与e₂相比，Vr×Vs和VR×V×Vs没有统计显著性。所以这误差e₂中，表B.4列出了合并非显表B.4方差分析表和不确定度(非显著性差异汇总)变异性来源平方和自由度平方平均值F比F(p=0.05)F(P=0.01)F(检验)重复，VR0.120.010.120-00.4034.12实验室，VL4.656939.2829.46Vk×V₁(一阶误差，e₁)0.899130.22972.904.46GB/T31402—2023表B.4方差分析表和不确定度(非显著性差异汇总)(续)变异性来源平方和自由度平方平均值F(检验)试样，Vs13二阶误差，e'2总计σ(e₂)=[V(e'₂)/3]1/²=(0.0228/3)/²=0.087 σ(e₁)={[V(e₁)-V(e'₂)]/3}¹/2=[(0.2997—0.0228)/3]1/2=0.304(资料性)抗菌率的计算用公式(NA.1)计算抗菌率。…………(NA.1)R′——抗菌率，%;U',——未经抗菌处理试样接种24h后回收的活菌数的平均菌数，单位为细菌数每平方厘米(cells/cm²);[2]ISO5725-2Accuracy(truenessandprecision)ofmeasurementmethodsandresults—Part2:Basicmethodforthedeterminationofrepeatabilityandreproducibilityofastandardmeasure-mentmethod[3]ISO14851Determinationoftheultimateaerobicbiodegradabilityofplasticmaterialsinanaqueousmedium—Methodbymeasuringtheoxygendemandinaclosedrespirometer[4]ISO14852Determinationoftheultimateaerobicbiodegradabilityofplasticmaterialsinan[5]ISO14855(both