TGXAS-家蚕核型多角体病毒(BmNPV)制备技术规程编制说明

团体标准《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术规程》（征求意见稿）编制说明项目来源根据《广西标准化协会关于下达2023年第十批团体标准制修定项目计划的通知》（桂标协〔2023〕50号）精神，由广西壮族自治区蚕业技术推广站提出，广西壮族自治区蚕业技术推广站、河池市蚕业技术推广站，广西农业工程职业技术学院共同起草的团体标准《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术规程》获批立项（项目编号：2023-1006）。项目背景及目的意义蚕桑业是我国的传统优势产业，在国际茧丝业中处主导地位，我国的原料茧和生丝产量占世界总量的70%以上，丝织品产量占世界三分之二以上，在世界茧丝业中处主导地位。“十五”以来，我区蚕业取得了令人瞩目的成就，蚕桑产业被广西自治区党委、政府列为11大新兴优势产业之一，是重要的扶贫产业，为广西农民增收、农业增效做出了重要的贡献。但是我国的养蚕业一直面临严重的病害威胁，其中家蚕血液型脓病是危害最为严重的一种，给蚕桑产业造成重大的经济损失。广西蚕区位于南亚热带，气候闷热多湿，利于病原的繁殖传播，是此病的高发地区，严重影响了广西蚕业的经济效益。家蚕血液型脓病是由家蚕核型多角体病毒（BmNPV）侵染蚕体引起的传染性和致病性很强的一类病，能通过食下感染和创伤感染2种途径感染蚕体。此病传染性极强，病程快，难控制。选育对血液型脓病具有抗性的家蚕品种，从根本上解决养蚕生产有效控制血液型脓病的难题，是从遗传上控制血液型脓病的有效措施。家蚕抗血液型脓病品种选育过程需要大量使用家蚕核型多角体病毒（BmNPV）。一对抗血液型脓病家蚕新品种的育成，需要添食病毒进行资源筛选、然后选配、固定成纯种。其中抗性资源的筛选需要经过育种工作者多年累代通过添食接种家蚕核型多角体病毒（BmNPV）进行蛾区或个体筛选；抗血液型脓病家蚕品种投入使用后，其母种也要再进行添食接种病毒从而维持品种的抗血液型脓病性能。目前广西已育成多对抗BmNPV家蚕品种并推广应用，但尚未有相关标准对该病原（BmNPV）的扩繁、提取方法、保存方法等方面作出相关规定。为了确保抗血液型脓病家蚕品种选育的正常进行，需要规范病原的制备技术，因此需制定《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术规程》。本项目研究团队长期从事家蚕育种和技术推广，取得了相当的进展。2012年已育成并通过广西农作物审定对血液型脓病具有高抗性的桑蚕新品种“桂蚕N2”、桂蚕8号、桂蚕9号、桂蚕10号等。经过前期研究，积累了丰富的经验，总结出2套方便高效规范的家蚕脓病病原(BmNPV)扩繁方法（活蛹注射、经口添食5龄起蚕）。扩繁得到的病蚕、病蛹经破碎、过滤，差速离心提取、即可收集保存备用。制备的病毒的活性和浓度均能满足抗家蚕血液型脓病品种选育需要。项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术规程》项目任务下达后，广西壮族自治区蚕业技术推广站成立了标准编制工作组，起草单位制定了起草编写方案与进度安排，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准编制工作。编制工作组下设三个组，分别是资料收集组、草案编写组、标准实施组。资料收集组负责国内外有关家蚕核型多角体病毒制备文献资料的查询、收集和整理工作，查阅前人对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术的研究情况。草案编写组负责起草标准草案、征求意见稿和标准编制说明、送审稿及编制说明的编写工作，包括后期召开征求意见会、网上征求意见，以及标准的不断修改和完善。标准实施组负责《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术规程》团体标准发布后，对标准进行详细解读，让相关从业技术人员了解标准，并根据标准要求规范工作，并对标准实施情况进行总结分析，不断对团体标准提出修正意见。（二）收集整理文献资料标准编制工作组收集了国内有关核型多角体病毒制备的文献资料。主要有：DB44∕T1239-2013油桐尺蛾核型多角体病毒杀虫剂生产技术规程，DB51/T1207-2011桑蚕血液型脓病诊断技术规程DB42/T675-2010茶尺蠖核型多角体病毒制剂生产及应用技术规程NY∕T3279-2018苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒NY/T3280-2018病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研讨，标准的主体内容确定家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术的术语定义、设施设备、复壮、扩繁、提取技术及保存。（四）调研及形成草案、征求意见稿工作小组在实地调研及实验基础上查阅了大量的国内外文献资料，并对本项目组多年来的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备方法进行系统总结，形成了标准的基本构架。2023年3-4月，在前期工作的基础之上，整合已有的参考资料中有关家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术要求，并结合广西在品种选育过程中制备家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成团体标准《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术规程》（草案）。2023年5月，标准起草工作组以草案为基础，提炼核心技术细节，并实际征求意见，通过收集的意见，标准编制工作组多次召开会议，对标准草案进行了反复修改和研究讨论。进一步讨论完善标准草案，形成团体标准《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术规程》（征求意见稿）和（征求意见稿）编制说明。标准制定原则（一）实用性原则本文件是在充分收集相关资料和文献，调研行业病毒制备技术情况，在现有国家、行业标准相关昆虫多角体病毒的制备技术要求的基础上，分析其它昆虫核型多角体病毒制备现状，结合广西壮族自治区蚕业技术推广站多年的病毒制备经验而总结起草的。具有较强的实用性和可操作性，便于理解掌握。（二）协调性原则本文件编写过程中注意了与家蚕病毒制备的相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。（三）规范性原则标准在试验验证和生产实践的基础上制定，以满足行业需求为目的，实现病毒制备的规范性。标准起草工作组严格参照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。标准主要内容及依据来源本标准确立了家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术的程序，界定了家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术涉及的术语和定义，规定了设施设备、制备原则的要求，以及病毒复壮、扩繁、提取保存等操作指示。（一）术语和定义明确了“复壮”“扩繁”的术语和定义，主要依据相关著作、论文、期刊等文献资料结合家蚕核型多角体病毒制备的实际操作给出。（二）设施设备设复壮扩繁房间、病毒提取房间。复壮扩繁房间应配备配置蚕架、蚕匾等附属蚕具，温湿度调控设备、消毒机具。病毒提取房间配备光学显微镜、低速离心机、纯水机、冰箱、血球计数器、移液枪等。（三）制备原则这是由于家蚕核型多角体病毒能经食下、创伤2种途径感染家蚕，为了养蚕生产的安全，就必须做到病毒制备过程中病毒制备过程中产生的含病毒的废渣废液在病毒灭活后作无害化处理，严防病毒扩散到养蚕环境中。（四）制备技术参考文献并结合起草单位多年的研究经验得出，具体见技术流程图。病原复壮病原复壮扩繁活体蛹注射组织破碎收集病蛹/蚕经口添食5龄蚕加超纯水保存清洗过滤离心去底部大颗粒沉淀离心收集沉淀图1家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备技术流程病原复壮病毒在保存过程中，保存时间越久，病毒的活性会降低。保存温度越高，活性丧失越快。为了保证病毒扩繁增殖的成功率，必须保证接种扩繁时使用的病毒的活力。所以，在扩繁增殖前，需要将保存的病毒接种到活体寄主中使其恢复活力。方法如下：将保存的需要复壮的家蚕核型多角体病原配制成高浓度（1×108PIBs/ml以上）的病毒悬液，取桑叶在病毒悬液中浸泡，捞起晾干表面水分后添食BmNPV敏感品系的5龄起蚕，第2餐开始普通桑叶常规饲养，5-6天后收集出现狂躁爬行、环节和节间膜肿胀、气门出现油浸斑，血液浑浊等典型病状但是皮肤还未破裂的活蚕，用75％的酒精消毒蚕体，晾干后剪尾角收集血液备用。取血后的蚕体经破碎过滤离心后收集多角体病毒。收集的病蚕血液用于后续扩繁增殖注射活蛹，取血后的蚕体经过破碎过滤离心后收集的多角体病毒则用于后续的经口添食5龄起蚕。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）侵染家蚕有两种方式：创伤感染和食下感染。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）以两种形式存在：包埋型病毒粒子（ODV）和出芽病毒粒子(BV)。其中ODV引起食下感染，BV引起创伤感染。ODV粒子外面包裹多角体蛋白，需要在碱性环境下才能溶解，释放出病毒粒子，进行感染。所以如果直接用收集的ODV粒子注射蚕蛹（创伤感染），是不会发病。病蚕血液含大量的BV，所以需要用病血注射。扩繁增殖扩繁采用注射活蛹和添食5龄起蚕的2种方式进行。1.活蛹注射：选择化蛹后24h～48h的BmNPV敏感品系健康蚕蛹，用注射器将复壮后取得的病蚕血液从蛹背部第2或第3环节接种到蛹体中。接种后的蚕蛹置于25-29℃的条件下发育，经过72h开始有零星发病，96～120 h，开始大批量发病，到发病中后期，蛹体出现环节松弛，蛹体开始发软的病状，即可收集发病蛹。收集的病蛹于-18℃冰箱保存。家蚕核型多角体病毒的稳定性与温度高低有显著差异。在高温下，病毒失去活性较快。我们对BmNPV在夏天的室温条件下（28-32℃，湿度74-85%）放置不同时间，再人工经口接种2龄起蚕，统计幼虫的发病率率。表一室温下放置不同时间BmNPV添食2龄起蚕（两广二号）的发病率BmNPV浓度放置1d发病率%放置15d发病率%放置30d发病率%2×10646.671.670.001×10788.3335.000.00放置1d的病蚕体内提取的病原的活力仍很强,在BmNPV浓度为1×107PIBs/mL时,感染家蚕发病率达88.33%，放置15d后,接种发病率下降至35%。30d后,病原基本失活,感染家蚕发病率为0。因此收集的病蚕、病蛹要及时低温保存，以防丧失活性。注射时蛹龄太早，蛹体柔软，极易受伤，操作容易使蛹受伤死亡；蛹龄晚则注射接种后收集的病毒中有蛾的鳞毛，影响病毒的纯度。甚至蛹期还未发病即化蛾。收集病蛹的时间不能过早，过早则繁殖效率低，病毒量少；收集晚了则蛹体液化，病毒损失大甚至不能收集，而且容易其它病菌侵染，影响病毒纯度，致使后面的使用效果不好。2.经口添食5龄起蚕：经复壮后的病原加入超纯水重悬，利用血球计数板和光学显微镜对多角体进行计数，并配置成较高浓度（1×108PIBs/ml以上）的病毒悬液备用。取桑叶在病毒悬液中浸泡，捞起晾干表面水分后喂食BmNPV敏感品系的5龄起蚕，第2餐开始普通桑叶饲养，5-6天后收集出现典型病症的病蚕，收集的病蚕于-18℃冰箱保存。蚕幼虫有5个龄期，5龄幼虫是蚕体最大的发育阶段，是1龄幼虫体重的10000倍左右，幼虫阶段增殖选择5龄是基于病毒生产效率及病毒产量考虑，而家蚕对BmNPV的抗性在同一龄期一般起蚕最低，所以选在5龄起蚕时添食病毒来增殖，提高感染率。组织破碎将收集到的病蚕或病蛹，加入适量超纯水破碎组织。此操作的目的是为了将病蚕或病蛹的病毒释放到胞外。过滤破碎后加入超纯水搅拌均匀，用80目滤网过滤，滤渣再加入超纯水搅拌再过滤，重复2次，收集滤液。滤网目数过高，则过滤不下去；过小则滤液杂质较多。离心收集的滤液500 rpm离心10 min，收集上层悬浮液，反复多次，直到500rpm离心10min后底部无大颗粒沉淀。将收集的悬浮液3000-4000rpm离心10min，留沉淀。此操作的原理是不同大小和比重的粒子有不同的沉降速度，核型多角体比重为1.26-1.28，利用不同转速可去除杂质，收集多角体。先500rpm离心可以去掉宿主组织细胞碎片及其它较大的杂质，3000-4000rpm则能使病毒沉淀，收集到核型多角体病毒。清洗在收集的沉淀中加入超纯水，重悬成悬浮液，3000-4000rpm离心10min，留沉淀。多次重复此步骤，直至沉淀呈现出灰白色。保存病毒沉淀等量加入50%甘油，用移液器吹打，将甘油与病毒沉淀混合均匀，封口贴标签于-18℃冰箱中保存。表二-18℃保存不同时间用6×106添食2龄起蚕发病率发病蚕头数存活头数发病率%-18℃保存时间1053177.21新鲜提取2025977.404个月922876.635个月431377.507个月611976.259个月822278.8511个月（添食的家蚕品种为芙蓉）可见保存于-18℃的病毒，保存时间在1年内，添食芙蓉2龄起蚕，发病率与新鲜病毒基本一致。另据《广西家蚕血液型脓病及生物药物防治的研究》报道50%甘油4℃保温13年的家蚕核型多角体样本，经离心后添食5龄幼虫，仍能使之感染发病。消毒清洗整个过程使用过的金属用具经煮沸消毒清洗，再75%酒精浸泡消毒；其它用具使用含有效氯1%的漂白精溶液浸泡消毒、清洗，按照DB45/T 83 《种茧育养蚕技术规程》的规定执行。表三家蚕核型多角体病毒对物理因素的稳定性（引至《蚕病学》）处理温度（℃）失活时间日光4020h湿热1003min干热10045min国内同类标准制修订情况及与法律法规、强制性标准关系经查阅，目前没有与家蚕核型多角体病毒（BmNPV）制备