GB-T 39917-2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测 稻

主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测稻国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I Ⅲ 13.2缩略语 2 2 2 2 35.3检测平台 3 35.5检测条件 4 46.1仪器设备 46.2试剂 5 5 57.1引物合成 5 8 97.4扩增产物分离 7.5数据分析 8品种纯度检测程序 8.2引物筛选和合成 8.4扩增产物分离 8.5数据分析 9结果计算与表示 9.1真实性鉴定 9.2纯度测定 ⅡGB/T39917—2021附录A(规范性附录)溶液配制 附录B(资料性附录)等位基因扩增片段信息 表1真实性鉴定引物 表3纯度测定候选引物 表B.1已知品种主要等位基因扩增片段信息 Ⅲ1本标准规定了稻(OryzasativaL.)品种GB/T3543.1农作物种子检验规程总则GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格2能够组合在一起电泳的，具有不同颜色或相同颜色而扩增产物片段大小不同的荧光标记的一组CTAB:cetyltrimethylammoniumbrodNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphates,脱氧核苷三磷酸。SDS:sodiumdodecylsu稻的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传3了已知品种的SSR指纹数据比对平台。表1引物可分为I、Ⅱ两组，编号PR01～PR24为I组，编号较高，可采用序贯方式，也可直接采用表1的48对SSR引5.3.1电泳是检测的关键环节，对于真实性鉴定，可选择采用PAGE电泳、毛细管电泳，但应注意以采用PAGE电泳、毛细管电泳，在选择等位基因扩增片段差异较大的引物前提下也可采用琼脂糖4稻穗，数量应不低于10个(总粒数不少于1000粒)。少含有20个个体，单个个体试样应至少含有5个个体。6.1.3.2PAGE电泳56.2.2PCR扩增编号引物名称(位置bp)退火温度℃引物序列(5′—3)荧光6编号引物名称染色体(位置bp)退火温度℃引物序列(5′—3)荧光7编号引物名称染色体(位置bp)退火温度C引物序列(5′—3荧光8编号引物名称染色体(位置bp)退火温度℃引物序列(5′—3)荧光DNA提取方法应保证提取的DNA质量符合PCR扩增的要求，DNA无降解，溶液的紫外光吸光97.3PCR扩增PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度参照表2进行配量，可以依据试验条件不同做相应调整。表2中的缓冲液若含有MgCl₂,不再加MgCl₂溶液，加等体积无菌水替代。原浓度终浓度10×缓冲液1Taq酶引物11每一种类的浓度。b)扩增：94℃变性45s,50℃~67℃(根据表1的引物设定退火温度)退火45s,72℃延伸取10μL扩增产物(见7.3.2),加入2μL6×加样缓冲液，混匀。在PCR扩增仪上运行95胶温度保持在约50℃。电泳时间的确定执行7.4.1.2.2的规定。将附着凝胶的长玻璃板放入固定液中，轻摇3min;用水快速漂洗，再取出放入染色液中轻摇(见7.3.2),充分混匀。从混合液中吸取1μL,加入DNA分析仪专用96孔板孔中。各孔再分别加入10min以上。瞬时离心10s后供备用。a)对于连带(pull-up)峰，即因某一位置某一颜色荧光的峰值较高而引起同一位置其他颜色荧光7.5.1.3对于PAGE电泳，位于其相应的等位基因扩增片段大小范围7.5.1.4采用混合样检测，无论是毛细管电泳还是PAGE电泳，结果表选择少量的对照),校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小。甄别后的特异峰落入Bin范纯合位点数据记录为X/X,杂合位点数据记录为X/Y(其中X、Y分别为该位点两个等位基因扩增片7.5.3.2采用毛细管电泳与SSR指纹数据比对平台比对的，按照数据导入模板的要求编号引物染色体(位置bp)退火温度℃引物序列(5′—3')荧光-—送验样品低于5.4.1.1规定数量的； 其他类型杂株个体个。—检测采用了其他SSR引物的名称及序列。溶液配制Na₂EDTA·2H₂O186.1g溶于800mL水中，加固体NaOH调pH至8.0,加水定容至1000mL,A.1.30.5mol/LHCI溶液浓盐酸(36%～38%)25mL,加水定容至500mL。A.1.45mol/LNaCI溶液A.1.5CTAB提取液用TE缓冲液分别配制正向引物和反向引物至浓度为5μmol/L的工作液。固体MgCl₂1.19g,加水定容至500mL。高压灭菌，-20℃保存。A.3电泳A.3.26.0%PAGE胶A.3.5疏水硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。10×TBE缓冲液500mL,加水定容至5000A.3.96×溴酚蓝-二甲苯青电泳指示剂50×TAE缓冲液100mL,加水定容至5000mL。A.4银染溶液冰醋酸100mL,加水定容至1000mL。A.4.2染色液硝酸银1.0g,加水定容至1000mL。固体NaOH15g和甲醛5mL,加水定容至1000mL。引物参照样品川7号白芒稻元子占稻天优华占川7号川7号安育早1号元子占稻川7号引物参照样品陆川早1号川7号宜香101旱轮稻陆川早1号元子占稻天优华占轮回01引物参照样品白芒稻轮回01白芒稻天优华占引物参照样品中籼168陆川早1号川7号昌米011天优华占引物参照样品轮回01川7号轮回01陆川早1号宜香101轮回01元子占稻川7号引物参照样品元子占稻旱轮稻轮回01陆川早1号元子占稻轮回01天优华占陆川早1号引物参照样品白芒稻轮回01陆川早1号轮回01元子占稻陆川早1号川7号川7号引物参照样品元子占稻宜香101轮回01轮回01元子占稻川7号引物参照样品宜香101元子