化学农药环境安全评价试验准则 第12部分：鱼类急性毒性试验 编制说明

《化学农药环境安全评价试验准则第12部分：鱼类急性毒性试验》编制说明（一）任务来源根据国标委发[2023]64号国家标准化管理委员会关于下达2023年国家标准制修订计划的通知（2023年1日发）第436项，由农业农村部农药检定所主持承担“化学农药环境安全评价试验准则第12部分：鱼类急性毒性试验”的修订工作，项目周期12个月。计划号20233002-T-326。（二）制定背景我国是农业大国，也是农药生产和使用大国。农药是一种特殊商品，它既是农业生产必需的生产资料，它的使用对控制病、虫、草害，保障粮食安全发挥着巨大的作用，但同时也可能对生态环境造成不容忽视的污染和危害，甚至对人类健康产生严重威胁。农药对生态环境的污染危害已成为全球广泛关注的重大环境问题，农药的安全性（包括环境和人体健康）管理也已逐步成为全球农药管理的重点。为了加强农药的环境管理，以便在使用农药的同时保护日益脆弱的生态环境，世界各国都加大了监管力度。农药环境管理的法律、标准不断完善，欧盟、美国、日本、澳大利亚、加拿大、巴西等国家和地区先后建立了农药环境风险评估技术体系。我国也于2016年发布了NY/T2882《农药登记环境风险评估指南》系列农业行业标准，建立了农药对水生生态系统、鸟类、蜜蜂、家蚕、地下水、非靶标节肢动物和土壤生物的环境风险评估方法。据农业农村部测算，2020年我国水稻、小麦、玉米三大粮食作物农药利用率约为40%，其余少数部分通过飘移、径流、淋溶等方式进入水环境，可能对水生生物造成危害，其中鱼类是主要的水生生物之一。因此，确定农药对鱼类的急性毒性是评估农药环境安全性的基础。2017年新发布的《农药登记资料要求》（农业部2569号公告）也规定化学农药申请农药登记时需要提交鱼类急性毒性试验资料以及环境风险评估报告。我国国家标准GB/T31270.12-2014《化学农药环境安全评价试验准则第12部分：鱼类急性毒性试验》（以下简称原标准）在我国的农药管理与新农药的开发研制过程中发挥了重要作用。但该标准中试验程序的描述比较简单，与国际标准不同处较多。随着绿水青山就是金山银山的理念深入人心，国家、社会和公众对我国的农药管理工作提出了更高的要求。因此，为了满足农药管理的需求，促进我国农药的国际贸易，进一步加强与规范农药对生态环境的安全评价工作，修订《化学农药环境安全评价试验准则第12部分：鱼类急性毒性试验》国家标准是非常必要的。《化学农药环境安全评价试验准则第12部分：鱼类急性毒性试验》国家标准的修订，旨在进一步完善我国农药环境安全评价技术体系，通过农药登记前的环境安全性评价，从源头控制农药对环境可能产生的污染。同时试验准则的标准化、规范化，可保证试验结果的准确可靠及可比性。因此，国家标准的修订，对于规范我国农药环境安全评价工作，使之适应新形势的要求，从而更好地为我国的农药登记和农药环境管理提供技术支持具有重要意义。GB/T31270.12-2014至今已实施近10年，广泛应用于农药登记、新农药研制筛选和科研等领域，测定化学农药鱼类急性毒性方面具备深厚的研究基础和实践经验。2019年OECD修改了适用于化学品测试的“鱼类急性毒性”试验指南（OECD,2019,GuidelinefortheTestingofChemicalsNo.203fishacutetoxicitytest）、EPA的相关指南文件（USEPA,2016,OCSPP850.1075:FreshwaterandSaltwaterFishAcuteToxicityTest）以及农业农村部农药检定所编写的《农药登记环境影响试验常见问题解答》可以为标准的修订提供方法参考。（三）起草过程（1）成立标起草工作组。自项目通知下达后，农业农村部农药检定所组织相关专家成立了标准起草工作组,提出标准修订实施方案。起草组成员主要包括：陈朗、杨海荣、周艳明、曲甍甍、张璋、蒲倩云、蒋金花、吴声敢、周彬彬、张海情、王宏伟。（2）文本起草。2024年2-6月，标准起草工作组查阅了经济合作与发展组织（OECD）、美国环保署（USEPA）关于鱼类急性毒性试验的试验准则，调研了我国农药登记环境影响试验单位的现状，确定了本标准的框架结构和主要内容。并同时按照GB1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》、GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分试验方法标准》的要求编写完成标准征求意见稿和编制说明。二、标准编制原则、主要内容及其确定依据，修订行业标准时，还包括修订前后技术内容的对比；本标准的主要内容包括化学农药鱼类急性毒性试验的试验条件、试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理、质量控制以及试验报告等的基本要求。修订这些内容时遵循科学合理、可操作可重复的原则。科学合理性体现在方法设计以确保所获得的毒性终点——半致死浓度（LC50）能准确反映供试农药的毒性属性为目标，从而为农药登记环境风险评估提供科学数据支持。可操作可重复体现在把“科学性第一”放在首位的基础上，标准修订过程中充分考虑国内实验室现有技术能力和平台，确保对试验各相关要素都进行了全面的、充分的描述，确保各要素的有关规定具有可操作性，确保农药登记环境安全性数据的可靠。同时，本标准还遵循以下原则：1.规范性原则一是格式的规范性，本标准的编制要符合GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》等基础标准的规定；二是指内容的规范性，标准规定的试验方法，力求做到试验条件的规范化。2.针对性原则本标准主要瞄准以化学农药为研究对象开展的鱼类毒性试验的标准化，标准旨在为化学农药这一特殊性被试物开展以登记为目的的试验提供具体依据。3.前瞻性、先进性原则充分考虑与国际通用试验准则的接轨。注意吸收国内外相关标准，国际农药环境安全性评价技术最新进展。1.范围。给出了本标准的适用范围。2.规范性引用文件。给出了难处理农药这类被试物配制试验药液时应采用的方法标准以及斑马鱼的标准化培养方3.术语和定义。给出了半致死浓度、静态/半静态/流水式试验法、被试物、参比物质等本标准涉及的术语、定义。4.原理。概述了化学农药鱼类急性毒性试验的目的和基本方法。5.试验条件。规定了试验期间温度、光照和饲养条件等方面的要求。6.试剂或材料。规定了供试生物（种类、鱼龄、驯养、健康状态等）、试验容器（规格、材质）和试验用水（类别、水质）等方面的要求。7.仪器设备。描述了鱼类急性毒性试验所需的仪器设备8．样品。对被试物和参比物的信息进行描述。其中，针对被试物给出了可供试验设计参考的各类数据信息。9.试验步骤。给出了试验方法（静态/半静态/流水式）的选择原则，预试验、正式试验和限度试验流程，试验药液的制备方法，染毒与培养方法，观察与测定方法（死亡数与中毒症状、体长与体重、水质参数化学分析方法，安乐死处理等试验实施方面的要求。10.试验数据处理。规定了数据整理方法、绘图要求，以及LC50统计方法、结果表达方法。11.质量控制。规定了对照的死亡率要求，溶解氧含量要求、被试物浓度检测要求以及参比物试验等质量控制要12.试验报告。给出了试验报告中至少应包含的内容。适宜的体长（全长以及水温、盐度、硬度等环境参数。14.附录B（规范性）试验用水水质要求。规定了试验用水理化参数指标和要求。16.附录D（规范性给出了鱼全长测定方法及示意经济合作与发展组织（OECD）于2019年更新了化学品鱼类急性毒性试验准则（GuidelineforTheTestingofChemicalsNo.203FishAcuteToxicityTest.后熟简称“OECD203”）。OECD203是国际通行的研究鱼类急性毒性试验准则，大多数国家农药管理机构接受按该准则开展的农药急性毒性试验资料。经过2019年的更新，其内容更为完善。本标准修订过程主要参考OECD203进行。除文字性修改外，本标准与OECD203的技术内容基本一致，但基于“可操作、可重复”、“针对性”等原则和近年来标准起草单位和国内主要实验室的经验，本标准的修订过程中在OECD203基础上进行了扩展和细化。具体如下：本标准限定了标准的适用范围为化学农药的鱼类急性毒性试验，即对被试物进行了限定。同时，鉴于NY/T3273的发布，可以为易挥发、难溶解化学农药提供方法指导，删除了GB/T31270-2014版关于“不适用于易挥发、难溶解的化学农药”的相关描述。2.规范性引用文件。给出了易挥发、难溶解等难处理农药这类被试物配制试验药液时应采用的方法标准——NY/T3273难处理农药水生生物毒性试验指南。NY/T3273主要参考OECDGD23（2000）制定，该导则文件也是OECD203的重要补充。另外规定了供试斑马鱼的培养应按照NY/T4195.3农药登记环境影响试验生物试材培养第3部分：斑3.术语和定义。给出了半致死浓度、静态试验法、半静31270-2014版相比，删除了被试物、参比物、原药、制剂、有效成分等的定义。4.原理。概述了化学农药鱼类急性毒性试验的基本流程和目的。在GB/T31270-2014版基础上进行了文字性修改。5.试验条件。对有关试验期间温度、光照和饲养条件等方面的具体要求参照OECD203进行了修改，与OECD203基本一致。6.试剂或材料。增加了试剂方面的总结，对于供试生物（种类、鱼龄、驯养、健康状态等）、试验容器（规格、材质）和试验用水（类别、水质）等方面的具体要求参照OECD31270-2014原本已增加了中国本土特有物种稀有鮈鲫，本次修订修改了其体长要求（由2cm~4cm修改为1cm~2cm与斑马鱼的体长修改一致（基于OECD203，采用幼鱼开展试验目前国内采用稀有鮈鲫开展试验的实验室已基本统一这一标准。7.仪器设备。仪器设备类型参照OECD203进行了修改，与OECD203基本一致。8．样品。对被试物和参比物的信息描述参照OECD203进行了修改，与OECD203准则中需要用到的基本一致。9.试验步骤。给出了试验方法（静态/半静态/流水式）的选择原则，预试验、正式试验和限度试验流程，试验药液的制备方法，染毒与培养方法，观察与测定方法（死亡数与中毒症状、体长与体重、水质参数浓度检测方法，安乐死处理等试验实施方面的要求。与OECD203基本一致，但做了以下补充和细化：1）针对被试物为农药中的特殊剂型——微囊悬浮剂、微囊悬浮-悬浮剂、缓释粒剂等缓释剂型，根据被试物特性及环境风险评估的需要，规定这类被试物应采用静态试验法。2）针对近年来评审中遇到问题，农药登记相关试验报告鲜有描述试验药液状态，导致对于有疑惑的试验结果进行原因分析时缺少该类关键信息，难以判断试验结果的科学性。因此，本次修订在9.3.2试验药液制备部分，规定了观察并描述试验液状态、颜色等的要求。2）针对农药作为被试物时，针对部分具有挥发性强、吸附性强、在测试条件下不稳定和/或难溶于水而难以达到或者保持暴露浓度的情形，要求参照NY/T3273《难处理农药水生生物毒性试验指南》采取相应措施配制试验药液。对于助溶剂的使用，进一步明确了可参考选用的种类，并注明二甲基甲酰胺和二甲基亚砜的潜在健康风险考虑，同时明确使用助溶剂时需确保所有处理组和对照组用量一致。3）操作方面，对于试验药液短暂静置后出现沉淀的情形，根据《农药登记环境影响试验常见问题解答》给出了去除沉淀物的操作方法，从而给试验人员提供更多的技术参考，详见9.3.2.3。4）针对被试物为农药中的特殊剂型——混配制剂，为避免实验室通过简单的直接离心、过膜等方法制备储备液，出现其中溶解度相对小的有效成分大部分被滤掉，进而导致试验药液中各有效成分的浓度比相较于产品中的配比发生极大变化的情况，在9.3.2.3部分特别指出应避免类似操作。5）在染毒（9.3.3）和培养（9.3.4）环节规定了受试鱼随机分配以及试验容器在培养区域内须随机摆放。6）与OECD203的要求一致，规定化学分析时应充分考虑被试物的“溶解态浓度”。在此基础上，为便于指导国内技术人员达到技术要求，给出了具体的水样前处理方法，详见9.3.6.3。7）与OECD203的要求一致，规定对于不稳定的被试物，对采集的样品应立即进行分析检测。在此基础上，给出了如未进行即时分析情形下的技术要求：须有储存稳定性分析数据的支持，进一步细化了操作要求。8）针对被试物为农药中的特殊剂型——微囊悬浮剂、微囊悬浮-悬浮剂，根据被试物特性及环境风险评估的需要，规定这类被试物应同时测定全态浓度和游离态浓度。10.试验数据处理。数据整理方法、绘图要求，以及LC50统计方法、结果表达方法等均参照OECD203进行了修改，与OECD203基本一致，但针对被试物为农药中的特殊剂型——微囊悬浮剂、微囊悬浮-悬浮剂，规定以全态浓度和以游离态浓度计的试验结果，便于全面了解其毒性并应用于风险评估。11.质量控制。对照的死亡率要求，溶解氧含量标准、被试物浓度检测要求以及参比物试验质量控制要求，与GB/T31270-2014、OECD203基本一致。新增了对试验中偏离试验准则的情形进行描述和评估的要求，有利于获得兼有完整性和科学性的试验报告。12.试验报告。给出了试验报告中至少应包含的内容。参照OECD203进行了修改，与OECD203基本一致,但根据国内实验室目前试验报告完整性方面的短板，做了一些细——要求必要时附水质检测报告、预试验结果；——要求描述试验药液外观、为测定溶解性浓度所做的相关操作、分析方法的重现性及灵敏度、回收率、最低定量限、试验过程中发生的可能影响结果的事件，偏离试验准则的情况、后果及相关解释与评价等；——对试验药液浓度分析结果的呈现形式做了细化，使数据更加直观、完整：要求将测定浓度与设定浓度、“旧液”和“新液”测定浓度以比值形式体现；要求被试物为混配制剂的，同时给出单个有效成分和有效成分之和的浓度等。13.附录A（规范性）规定了供试鱼的种类、体长（全长）及水温、盐度、硬度要求，参照OECD203进行了修改，与OECD203基本一致，增加了胖头鱥、孔雀鱼、蓝鳃太阳的是增加了本土物种稀有鮈鲫的相关信息。新增，与OECD203基本一致。15.附录C为新增资料性附录，主要为鱼类中毒症状描述提供标准化术语参考。该内容参考OECD附录4制定。附录4的目的是鼓励相关实验室积累基础数据，通过将受试鱼个体单独标记（如注射色素、植入可见性标记、形态学标记）并记录其随时间推移出现的具体症状（如表C.1中的子类别C.1.1.1并与濒死、死亡情况相关联，基于长期观察积累的数据和证据权重方法，逐步建立受试鱼人道主义终点的识别、评估和使用方法，以及在试验结束前对个别受试个体实施安乐死的指南。在本标准中主要用于指导中毒症状的观察和描述，要求至少描述和记录C.1.1级别的症状，鼓励记录到子类别C.1.1.1。16.附录D是规范性附录，规定了受试鱼全长的测定方法并提供了示意图。17.由于我国目前对农药的环境管理是基于对鸟类、水生生态系统、蜜蜂、家蚕、非靶标节肢动物、土壤生物和地下水的风险评估结果，而不是简单地依据对非靶标生物的毒对鱼类毒性等级划分相关内容”。1)更改了标准适用范围，修订后的标准适用范围可涵盖易挥发、难溶解化学农药（见第1章,2014年版的第12)增加了规范性引用文件款项（见第2章）。3)更改了术语和定义，删除了供试物、化学农药、原药、制剂、有效成分、参比物质的定义（见第3章，2014年版的2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.104)更改了试验期间水温、盐度、硬度要求，细化了试验容2014年版的4.1.5、附录A表A.15)更改了试验期间光照要求，细化了光照强度（见5.2,2014年版的4.1.16)更改了饲养条件要求，细化了承载量要求、曝气有关操作要求（见5.3,2014年版的4.1.17)增加了试剂要求，包括用于pH调节、助溶、参比物试验等的相关试剂的基本信息和级别要求（见6.18)更改了供试生物要求，新增了胖头鱥、孔雀鱼、蓝鳃太种类增加且涵盖了海洋鱼类，修改了根据最新版OECD203斑马鱼体长，并作为参照修改了稀有鮈鲫体长，细化供试鱼健康状态、驯养期死亡率、疾病治疗等方面的要求（见6.2,2014年版的4.1.1）9)增加了试验容器材质等方面的基本要求（见6.310)更改了试验用水要求，增加了试验用水类别，修改了水质要求及其检测频率（见6.4,2014年版的4.1.511)更改了仪器设备相关要求，新增盐度计、光照监控设备、温湿度监控设备、流水式试验装置、化学分析设备、前处理设备、移液器等（见第7章,2014年版的4.1.4第8.1部分,2014年版的4.1.213)更改了试验方法的选择要求，新增了有关微囊悬浮剂等的试验方法要求（见第9.1部分,2014年版的4.2.114)更改了正式试验试验设计相关要求，修改了浓度设置几何极差（见9.3.1,2014年版的4.2.315)增加了试验药液制备方法相关要求（见9.3.216)更改了染毒、培养方法，要求将供试鱼随机加入到9.3.4,2014年版的4.2.317)更改了观察与测定方法，修改了死亡数与中毒症状观察频率与观察方法；新增了鱼体长与体重的测定方法，修改了水质参数测定频率、方法（见9.3.5,2014年版的4.2.318)增加了浓度检测方法（见9.3.619)增加了安乐死处理要求（见9.620)增加了数据整理要求（见10.121)更改了数据统计方法（见10.2,2014年版的4.322)更改了质量控制条件，新增了描述和评估试验偏离23)更改了试验报告相关要求，新增了对试验方法特别是浓度设置依据、试验药液配制、外观、化学分析及其前处理方法、中毒症状观察、化学分析典型谱图等的报告要求，以及对分析方法验证结果、试验药液浓度检测结果报告的要求，细化了被试物信息、供试生物信息、试验条件、试验结果（水质参数、观测与统计）等的要附录A表A.1,2014年版的附录A表A.125)更改了部分鱼种的全长及水温有关要求（见附录A表A.1,2014年版的附录A表A.126)删除了农药对鱼类急性毒性等级划分（2014年版的28)增加了供中毒症状观察与描述参考的资料性附录29)增加了受试鱼全长示意图（规范性附录D）。三、试验验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效益、社会效益和生态效益；为验证该方法在国内实验室的可行性和各实验室间结果的可重复性，标准制定工作组组织开展了验证试验。由北京绿城堡农业科技有限公司、浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所、沈阳沈化院测试技术有限公司安全评价中心等三家实验室采用95%高效氯氟氰菊酯原药开展了鱼类急性毒性试验。鱼类急性毒性试验结果汇总见表2。表2鱼类急性毒性试验验证试验结果汇总表验证试验结果显示，三家实验室的试验结果基本一致，表明本标准规定的试验方法在国内实验室具有较好的可操作性、可重复性。目前国际通用的最新的研究农药鱼类急性毒性的试验准则是经济合作与发展组织（OECD）于2019年发布了化学品鱼类急性毒性试验准则（OECD(2019).TestGuidelineNo.203:Fish,acutetoxicitytest,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals.），大多数国家农药管理机构接受按该准则开展的农药鱼类急性毒性试验资料。本标准在OECD203基础上制定，除文字性修改外，本标准与OECD203的技术内容基本一致，但为适应我国国内鱼种等实际情况做了部分修改（见主要内容确定依据部分）。与OECD等试验方法标准相比，本标准主要技术内容与其基本相同，具有国际先进水平。据估计，我国农药的有效利用率约为40%，其余少数部分通过飘移、径流、淋溶等方式进入水环境，可能对水生生物造成危害，其中鱼类是主要的水生生物之一。农药对鱼类的毒性是评估农药环境安全性的基础，我国《农药登记资料要求》也规定化学农药申请农药登记时需要提交鱼类急性毒性试验报告，其中原药登记需要提供一种温水鱼和一种冷水鱼的鱼类急性毒性试验报告。本标准的制定实施有利于规范农药的鱼类急性毒性试验，明确农药对鱼类的急性毒性，试验结果可用于农药对水生生态系统的环境风险评估，减少高风险农药的登记使用，促进农业的可持续发展、保障生态环境安全。四、与国际、国外同类标准技术内容的对比情况，或者与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况；本标准制定和起草过程中