糖尿病肾病肾损伤机制的研究进展苏宁教授课件

题纲糖尿病肾病概述临床分期；肾脏的病理变化；肾脏功能障碍及结构损害的基础

DN时肾损伤机制的研究进展

TGF-β/Smads信号转导系统

TGF-β下游因子肾脏微环境中复杂的生物活性物质网络第1页/共40页糖尿病肾病概述糖尿病肾病（DiabeticNephropathy，DN）是指糖尿病（diabetesmellitus，DM）时发生的肾小球、肾小管、肾间质和肾血管病变。近年来发现除糖尿病直接引起的肾脏病变外，糖尿病患者常伴发多种与糖尿病无直接关系的肾脏疾病，统称为糖尿病肾脏疾病（Diabetickidneydisease，DKD），其概念范围较DN更广。第2页/共40页DN的临床分期

根据Mogensen分类，DN五期分别是：（1）肾脏肥大，肾小球高滤过期（2）肾损害无临床表现期（3）微量白蛋白尿期（4）临床DN期（5）肾衰期

DN进程中第1、2期为临床前期，不属于临床DN诊断。病人出现持续微量白蛋白尿表示开始进入DN进展期。第3页/共40页DN时肾脏的病理变化根据Mogensen分类，DN早期即可出现肾脏肥大，主要由于高灌注引起的肾小球毛细血管扩张所致，肾脏无器质性损害；肾脏的器质性损害多发生于病程5年以上（即DN第2期后）的DM患者。但有人观察了11例病程在1～4年的1型DM患者的肾穿刺标本，电镜下已可观察到GBM有节段性增厚和足突节段性融合。提示DN的肾脏形态损伤出现早于功能障碍，且进行性加重，贯穿DN整个过程。第4页/共40页肾小球肥大，肾小球基底膜（glomerulusbasementmembrane，GBM）和肾小管基底膜（tubulebasementmembrane，TBM）增厚，肾小球系膜基质增多，肾小球无细胞性结节状硬化，肾小囊玻璃滴状病变，肾小球毛细血管袢的纤维素样或类脂样帽状病变及肾小球毛细血管微血管瘤形成。DN的主要病变是细胞外基质增生，所以又被称为糖尿病肾小球硬化症（Diabeticglomerulosclerosis），是糖尿病导致肾损伤致终末肾病的主要原因。DN时肾脏的病理变化第5页/共40页动物DN病理变化人和啮齿类动物在DN病理上的相同之处是均有肾脏肥大、弥漫性和渗出性肾小球病变，GBM增厚，系膜基质扩张和系膜细胞增生。肾小管上皮细胞空泡变和颗粒变性、TBM增厚、间质纤维化及巨噬细胞浸润均与人类肾脏改变相似。但啮齿类动物缺乏结节性肾小球病变和出入球小动脉的玻璃样变。第6页/共40页DN时肾脏功能障碍及结构损害的基础DN的肾功能障碍主要表现为GFR降低致代谢产物排泄障碍、滤过膜对大分子蛋白质的通透性增加致大量蛋白尿产生。DN的肾脏结构损害主要是基底膜增厚、系膜扩张，继而出现肾小球、肾小管、间质纤维化，最终导致肾脏结构严重破坏，功能极度减退。肾脏的功能障碍与结构损害在DN的进程中互为因果、相互促进。大量研究证实，DN时肾脏功能及结构变化的基础主要是细胞外基质过度积聚及足细胞结构、功能障碍。第7页/共40页细胞外基质过度积聚细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）成分主要为：透明质酸（hyaluronic，HA）层黏连蛋白（lamminin，LN）

IV型胶原(typeIVcollagen，IV-C)

纤维连接蛋白（fibronectin，FN）。ECM在肾小球、肾小管的过度积聚可导致基底膜增厚、系膜区增宽、间质纤维化，最终导致肾硬化。第8页/共40页ECM过度积聚的原因ECM过度积聚的原因有生成增多和降解减少两方面。肾小球系膜细胞（glomerulusmesangialcell，GMC）是合成和分泌ECM的主要细胞。目前研究较多的与基质降解有关的酶是基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）。MMPs由系膜细胞、滤过膜内皮细胞及肾小囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞、浸润的巨噬细胞等合成和分泌，以非活性酶的形式存在于细胞周围。第9页/共40页足细胞的变化肾小球脏层上皮细胞又称足细胞(Podocyte)，是一种终末分化多突状细胞，通过足突固定在基底膜上。两相邻足突间的裂隙称为裂隙孔，其上有裂隙隔膜，构成肾小球阻挡血浆大分子物质滤过的孔径屏障。足细胞表面覆盖着由涎酸及硫酸蛋白多糖所组成的阴离子衣，是肾小球电荷屏障重要组成部分。DN时足细胞的损伤形式包括数量减少、密度减低、足突扁平融合、以及足细胞上各蛋白表达的异常，进而破坏足细胞孔径屏障及电荷屏障，导致蛋白尿发生、肾小球硬化。第10页/共40页造成DN发生与发展的因素较为复杂，主要分为遗传因素和非遗传因素。遗传因素主要与基因多态性相关。非遗传因素包括代谢、血流动力学以及相关细胞因子的异常变化。DN时肾损伤机制的研究进展第11页/共40页相关细胞因子合成、释放重要信号传导通路活化ECM合成增加、降解减少足细胞相关蛋白缺失肾小管重吸收功能障碍肾脏结构损害及功能障碍氧化应激状态、局部炎症改变、肾素血管紧张素系统、血管紧张素与蛋白激酶的相互作用第12页/共40页肾脏局部微环境中的细胞因子网络几乎所有肾脏固有细胞，包括系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞等，均具有产生细胞因子的能力，并且同时又是细胞因子生物学作用的靶细胞。组织细胞，包括肾脏细胞产生的细胞因子主要通过旁分泌或自分泌形式在其生成的微环境中直接发挥作用，但在某些情况下也可进入循环，引起全身性效应。大量研究显示，糖尿病的高血糖状态可激活肾脏许多局部细胞因子，目前的研究发现这些物质与DN的发生发展有密切关系，其中以TGF-β为复杂细胞因子网络的中心因子。第13页/共40页TGF-β信号转导系统转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)最早是由Delaro和Todaro于1978年在研究病毒转化细胞过程中发现的，哺乳动物主要有TGF-β1、2、3三种形式。肾脏TGF-β1表达最多，主要在肾小管上皮和肾小球。TGF-β受体(TβR)有5种不同类型(Ⅰ-Ⅴ型)，其中Ⅰ、Ⅱ两型受体的胞质区段有丝/苏氨酸激酶活性，与受体后细胞内通讯有关。大量实验及临床研究发现，在糖尿病病人和实验型糖尿病动物的肾脏、血液和尿中TGF-β水平均升高。DN时肾脏GMC合成TGF-β1增多已基本成定论，同时认为糖尿病早期的肾小球肥大是TGF-β1介导的。第14页/共40页TGF-β在DN进程中的主要作用TGF-β通过受体信号传递发挥以下生物学作用：①调节细胞增殖和分化。TGF-β抑制大多数肾细胞（如肾近曲小管上皮细胞、肾小球脏层上皮细胞和肾小球毛细血管内皮细胞）的增殖和分化，对于来源于间质的细胞（如系膜细胞、成纤维细胞）能同时产生促进作用或抑制作用。此外，TGF-β还可以通过增大细胞直径造成细胞肥大。②增加ECM蛋白含量。TGF-β可增加Ⅰ、Ⅲ、IV型胶原、FN和蛋白多糖的合成，并抑制其降解。③参与炎性反应、组织修复、胚胎发育和免疫调节过程。第15页/共40页TGF-β/Smads信号通路的激活TGF-β与受体TβR结合后的信号转导与一组信号蛋白Smad蛋白有关。Smad蛋白是目前所知TGF-β受体的胞内激酶底物，介导了TGF-β的胞内信号转导。目前，在哺乳动物已分离鉴定的Smad蛋白有9种（Smad1-9），Smad2、3参与TGF-β信号传导，Smad4是TGF-β家族各类信号传导过程中共同需要的介质。DM时肾脏存在着TGF-β/Smads信号通路的激活。高糖可能是引起TGF-β/Smads信号通路激活的原因之一。第16页/共40页TGF-β/Smads信号通路对ECM合成及降解的影响TGF-β可促进ECM各蛋白成分合成并阻止其降解。TGF-β可通过Smads信号通路刺激多种基质蛋白的基因表达。TGF-β可通过阻止MMPs的合成和刺激TIMPs的产生来阻止基质降解。第17页/共40页TGF-β/Smads信号通路介导足细胞凋亡的作用体内和体外研究均发现TGF-β可通过激活p38MAPK和上调Smad7来诱导足细胞的凋亡。p38MAPK被激活后可使哺乳动物细胞凋亡的关键酶caspase-3活性增加，而Smad7可通过抑制抗凋亡因子NF-κB的活性来加强TGF-β诱导的足细胞凋亡作用。第18页/共40页高糖等因素TGF-βSmads激活ECM合成增加降解减少足细胞凋亡？？第19页/共40页TGF-β下游因子——结缔组织生长因子结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）通过免疫组化技术在正常大鼠和人肾小球检测不到，在DN时表达上调。实验发现，db/db大鼠的GMC在暴露于TGF-β、高糖等情况下，明显诱导CTGFmRNA表达增加。肾近端小管上皮细胞中也发现TGF-β能诱导CTGF合成，且抗CTGF抗体及CTGF反义寡聚脱氧核苷酸均能抑制TGF-β诱导的ECM蛋白合成。故有人认为CTGF与TGF-β的关系密切，CTGF是TGF-β的下游分子，在促进肾脏纤维化中具有重要作用。

第20页/共40页TGF-β下游因子——结缔组织生长因子CTGF通过自分泌、旁分泌途径发挥以下生物学功能：①促进细胞趋化、增殖。CTGF能促进间质来源细胞(间质成纤维细胞、肾小球系膜细胞)从G0期进入G1期，但阻止细胞从G1期过渡到S期，且对成纤维细胞有强烈的趋化作用，从而导致系膜区细胞增殖和成纤维细胞积聚。②提高ECM含量，诱导基质沉积。CTGF能促进多种ECM蛋白成分如Ⅰ型、Ⅲ型、IV型胶原和FN的合成，促进α5整合素表达而增强细胞与基质相互作用，促使TGF-β以无活性的前体蛋白形式分泌而扩大上述效应。CTGF的众多生物学作用类似于TGF-β。第21页/共40页血小板源性生长因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）B链被认为是TGF-β的下游介质，用可溶性PDGF-B受体阻滞剂可以减少系膜细胞增生和ECM沉积。糖尿病时，葡萄糖在早期引起TGF-β1转录升高是通过p38MAP激酶活化，另外，葡萄糖引起PDGF-B依赖性TGF-β1翻译水平升高，是通过增加细胞内PDGF的敏感性完成。这解释了临床上血糖控制不好的糖尿病患者可导致DN的进行性发展的现象。TGF-β下游因子——血小板源性生长因子B链第22页/共40页高糖等因素TGF-βSmads激活ECM合成增加降解减少足细胞凋亡？CTGFPDGF第23页/共40页DN时肾脏微环境中复杂的生物活性物质网络细胞因子网络蛋白激酶信号传导系统肾素血管紧张素系统肾脏局部炎症反应肾脏局部氧化应激反应第24页/共40页肾素血管紧张素系统肾素血管紧张素系统（reninangiotensinsystem，RAS）由肾素、血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)、血管紧张素Ⅰ转换酶（angiotensinⅠconvertingenzyme，ACE）、AngⅡ以及血管紧张素受体（angiotensinreceptor，ATR）等成分组成。对机体心血管系统的调节、水盐平衡及内环境自稳态的维持有重要作用。随着分子生物学技术的进展，证实了肾组织存在其自身的RAS，通过旁分泌作用调节肾小球滤过、肾小管重吸收及系膜细胞增殖、收缩等功能。DN时肾脏AngⅡ活性增高第25页/共40页AngⅡ与TGF-β1在DN时，异常的葡萄糖代谢是导致TGF-β1升高的主要因素，此外RAS亢进使AngⅡ产生过多也是引起高血糖状态下TGF-β1表达增加的另一重要因素。AngⅡ可以通过增强TGF-β启动子的活性上调TGF-βmRNA的表达，通过诱导TGF-β1产生而增加ECM合成。AngⅡ不仅可以上调TGF-β1表达，还可促进细胞新合成释放的TGF-β1活化。

第26页/共40页蛋白激酶C信号传导系统蛋白激酶C（proteinkinase，PKC）是l977年Nishizuka发现的可被Ca2+/磷脂激活的一类丝/苏氨酸激酶，由多种不同结构不同生物特性的同工酶（亚型）组成。PKC各亚型在信号传导和功能上有特异性，其短期效应包括激素、神经递质及细胞因子的释放，离子通道的转运，代谢调节，细胞收缩及免疫和炎症反应；长期效应包括调节基因表达，蛋白质合成，细胞增殖分化。PKC静息状态下主要以无活性的形式存在于胞浆中，受到外界刺激时受其特异性底物蛋白吸引自胞浆向胞膜转移。PKC的膜转移现象为PKC激活的重要标志。第27页/共40页蛋白激酶C信号传导系统PKC的活化有多条途径，DM时主要通过从头合成二脂酰甘油（diacylglycerol，DAG）途径活化PKC。DAG是体内最主要的内源性PKC激动剂。DM时激活的PKC通过其下游事件参与DN的发生发展：⑴磷酸化磷酯酶A2，使NO产生增多，扩张血管，参与肾小球早期高滤过。⑵磷酸化肌动蛋白结合蛋白，降低细胞与细胞间、细胞与基质间连接，从而增加肾小球血管内皮细胞通透性，发生蛋白尿。⑶PKC可促进TGF-β表达上调。第28页/共40页AngⅡ与PKCAngⅡ通过其受体AT1激活酪氨酸激酶（tyrosinekinase，TK），TK通过一系列生化途径促使DAG激活PKC。AngⅡ激活PKC后又可以通过增加近端小管重吸收葡萄糖来促进高糖激活PKC能力。也就是说，高糖和AngⅡ对PKC可有协同刺激作用。第29页/共40页PKC与TGF-β1PKC可使Smad2和Smad3MH1结构域磷酸化，而MH1结构域是Smad与DNA直接结合的部位，这提示PKC有影响TGF-β1/Smad信号通路的作用。第30页/共40页核转录因子-κB核转录因子-κB（NuclearFactorKappaB，NF-κB）最早于1986年Sen和Baltimore在分析B淋巴细胞核提取物中发现的一种核蛋白因子，它能与免疫球蛋白κ链基因的内源性增强子κB序列特异性结合，因而得名。NF-κB在组织细胞中广泛存在，肾小球系膜细胞、毛细血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和经血液循环进入肾脏的免疫细胞都存在NF-κB转录调控。第31页/共40页核转录因子-κB细胞在静息状态下，NF-κB与其细胞内抑制性蛋白IκB结合形成NF-κB/IκB复合物，以非活性形式存在于细胞浆中，当细胞受到内外刺激后，IκB磷酸化，使NF-κB/IκB复合物解离，随后NF-κB进入细胞核内与特异性基因启动子或增强子区域“5-GGGRNYYCC-3”（κB序列）结合，启动或调节基因的转录。有DNA结合活性的NF-κB都是一个二聚体，其中研究最多的是p50/p65二聚体。DN时NF-κB可被多种因素异常激活，如PKC及ROS途径第32页/共40页核转录因子-κBNF-κB可从分子水平调节许多信号传导系统的功能，主要包括：①介导炎症反应；NF-κB可高效诱导各种细胞因子（如IL-2、IL-6、INF-α）、黏附因子（ICAM-1、VCAM-1）、趋化因子（MCP-1、C3），调控参与炎症反应放大与延续的多种酶。②参与细胞增殖和凋亡；研究发现[56]，细胞周期蛋白Dl（cyclinD1）启动子含有2个NF-κB结合位点，NF-κB活化具有促进cyclinD1表达及G1/S期转换的功能，导致细胞周期调节失控，细胞表现为无限增殖和自主分裂。所以激活GMC中的NF-κB可明显促进GMC增殖。第33页/共40页AngⅡ与NF-κB研究发现血管紧张素原基因及AT1R基因的启动子区域含有NF-κB的结合序列，提示激活后的NF-κB既可增加血管紧张素原表达、又可增加AT1R的表达，从而增加