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2015-10-09发布2015-12-01实施1猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫PPV:猪细小病毒PorcineparvovirusOD:光密度opticaldensityr/min:转/分钟rotationsperminute4.1猪细小病毒VP2重组蛋白(re-VP2)纯化重组蛋白。获得的重组蛋白浓度应≥1mg/mL,纯度应≥95%。具体过程见附录A。选取5月龄健康猪2头，用猪细小病毒疫苗按规定剂量进行免疫，间隔3周免疫2次，第二次免疫1个月后开始采血分离血清，用血凝抑制试验测定其抗体效价。当抗体的血凝抑制效价达到1:1024时采血分离血清，将血凝抑制效价为1:1024的阳性血清用样品稀释液(参见B.4)进行1:50稀释，即为2以纯化的猪细小病毒VP2重组蛋白(re-VP2)作为包被用抗原，将重组蛋白re-VP2用包被液稀释至3pg/mL,每孔加入100μL(每孔抗原包被量为300ng),37℃包被2h,用洗涤液洗板3次，每次每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h,洗板同上。将兔抗猪酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度，每孔加入100pL,37℃作用1h,洗板同上。值ODN。阳性血清对照OD₄₅0平均值ODp≥0.5,阴性血清对照OD₄₅0平均值O8.1相关试剂需在2℃~8℃保存，使用前平衡至室温。3猪细小病毒VP2蛋白的表达及纯化猪细小病毒NADL-2株；大肠杆菌DH5a和BL21(DE3)感受态细胞、pMD18-T克隆载体、A.2器材和设备VP2-P1:5'-AACAGGATCCCACAGTGACATTVP2-P2:5'-AGAAAGCTTATGCTTTGGAGCTA.4猪细小病毒结构蛋白VP2抗原优势区基因序列本标准表达的猪细小病毒结构蛋白VP2抗原优势区基因将PPV接种PK15细胞，在5%CO₂的条件下37℃培养24h～36h,当70%的细胞出现细胞病变时，收集培养物，反复冻融3次。用核酸提取试剂盒提取病毒DNA,然后用VP2-P1和VP2-P2引物BamHI和HindII双酶切pMD18-T-VP2和pET-32a,将VP2基因片段连接到(DE3)菌种5pL,接种至5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基(蛋白胨1%,氯化钠1%,酵母提5NaHCO₃(分析纯)2.98gNa₂CO₃(分析纯)1.5gNaCl(分析纯)8.0gKH₂PO₄(分析纯)0.2gNa₂HPO₄·12H₂O(分析纯)2.9gKCl(分析纯)0.2g硫柳汞(分析纯)0.1gTween20(分析纯)0.5mL加双蒸水至1000mL,调至pH7.4。B.3封闭液(10%小牛血清/PBST溶液，pH7.4)NaCl(分析纯)8.0gKH₂PO₄(分析纯)0.2gNa₂HPO₄·12H₂O(分析纯)2.9gKCl(分析纯)0.2g加双蒸水至1000mL,调至pH7.4。B.6底物显色液(TMB-过氧化氢尿素溶B.6.1

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