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转基因动物及其产品成分检测羊内标准基因定性PCR方法2014-07-07发布2014-08-01实施工1农业部2122号公告—2—2014本标准规定了羊内标准基因PHPAP的定性PCR检测方法。GB/T6682分析实验室用水规格PHPAP基因PHPAPgene编码类远古内源性逆转录病毒基因(putativeHERV-K_5q13.3provirusancestralEnvpolypro-根据羊PHPAP基因序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期的5.310mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后再加水定容至25.11氯仿/异戊醇(24:1):将氯仿和异戊醇按照24:1的比例配制。PHPAP-F:5'-CGGTGTATCGGCAAGPHPAP-R:5'-CAAAAGGGGTGTCCT3农业部2122号公告—2—20146.2PCR扩增仪：升降温速度>1.5℃/s,孔间温度差异<1.0℃。7分析步骤7.2.1血液样品7.3.2加入0.5倍体积的Tris-饱和酚和0.5倍体积的氯仿/异戊醇(24:1),缓慢颠倒离心管10min,4℃,12000g离心10min,将上清液移至另一1.5mL离心管。7.3.3加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),缓慢颠倒离心管10min,4℃,12000g离心10min。7.3.7将DNA适当稀释或浓缩，使其OD₂6值在0.1～0.8的区间内，测定并记录其在260nm和凝胶电泳检测DNA完整性。DNA溶液OD₂6/OD₂8o值应在1.7～2.0,或质量7.4.1试样PCR反应7.4.1.1每个试样PCR反应设置3次平行。水4农业部2122号公告—2—201410×PCR缓冲液dNTPs混合溶液(各2.5mmol/L)总体积“—”表示体积不确定。如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液。根据Taq酶的浓度确定其体积，并相应7.4.1.4进行PCR反应。反应程序为：94℃变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,7.4.2对照PCR反应质量分数为0.1%～1.0%的动物DNA作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与7.4.1相同。增片段是否为目的DNA片段，按照7.7和7.8的规定执行。按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。将回收的PCR产物克隆测序，与羊内标准基因序列(参见附录A)进行比对，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。阳性对照PCR反应中，羊PHPAP内标准基因得到了扩增，且

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