遗传病致病基因的克隆课件

遗传病致病基因的克隆和功能研究遗传病致病基因的克隆遗传病

遗传病(geneticdiseases)是由于遗传物质改变而导致的疾病。遗传物质是存在于细胞内的、决定特定性状的基因。

遗传病致病基因的克隆疾病基因的定位和克隆疾病基因定位的含义疾病基因定位，是指将致病基因定位到人类染色体的某一区段上。疾病基因克隆疾病基因的克隆是指疾病基因的鉴定，找到导致疾病的致病基因。遗传病致病基因的克隆

分类发病率(%)

基因病

单基因病（MonogeneticDisease）2.5

常染色体显性遗传病0.9

常染色体隐性遗传病1.3

性连锁遗传病0.3

线粒体病

多基因病（PolygeneticDisease）18.0

染色体病

0.54

常染色体异常的疾病0.36

性染色体异常的疾病0.182遗传性疾病的分类及发病率遗传病致病基因的克隆单基因遗传病

由于单个基因突变所引起的疾病，这类疾病的遗传符合Mendel遗传规律，如血友病、色盲、白化病。

遗传病致病基因的克隆多基因遗传病

由多个微效基因与环境因素共同作用所引起的疾病。

如：精神分裂症、高血压、冠心病等

遗传病致病基因的克隆

染色体病

染色体病（chromosomaldisorders）由于染色体数目或结构异常所引起的疾病，如唐氏综合，脆性X染色体综合征。遗传病致病基因的克隆人体细胞的遗传物质人的基因组大小：30亿个碱基对个rRNA基因和22个tRNA基因，13个编码蛋白质基因，编码序列占93%。遗传病致病基因的克隆人类的基因数目遗传病致病基因的克隆如何克隆遗传病的致病基因？1.PCR2.DNA多态性遗传标记遗传病致病基因的克隆PCR（

PolymeraseChainReaction）KaryMullis1993年诺贝尔化学奖得主1973年获加州大学伯克利分校生物化学博士快速扩增目的DNA片段，30次循环将扩增上10亿个靶DNA片段的拷贝遗传病致病基因的克隆遗传病致病基因的克隆KaryMullis

在Cetus公司工作期间，他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，但为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年5月一个星期五的晚上开车去郊外度假的路上联想起DNA复制的过程，引发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法。遗传病致病基因的克隆PCR背后的故事遗传病致病基因的克隆PCR背后的故事遗传病致病基因的克隆DNA多态性

DNA多态性是指染色体DNA等位基因中核苷酸排列的差异性，分为序列多态性和序列长度多态性。遗传病致病基因的克隆DNA多态性遗传标记第一代遗传标记：ABO血型位点标记，HLA位点标记，限制性片段长度多态性（RFLP）第二代遗传标记：微卫星标记（microsatellitemarker），又称短串联重复（STR）第三代遗传标记：1996年MIT的LanderES提出了SNP(singlenucleotidepolymorphism)遗传标记系统新的遗传标记：拷贝数变异。遗传病致病基因的克隆

DNA多态在医学遗传学中的应用

1.基因定位：DNA多态在人类基因定位中起着非常重要的作

用。

2.要确定个体之间的亲缘关系，DNA多态分析是最有效的方法，可以通过检测待分析个体的DNA多态位点，通过等位基因

分析确定他们之间的血缘关系。

3.追踪额外染色体起源：如在对21三体患者进行病因分析时

，通常需要分析21三体患者额外的21号染色体的起源，可以

通过DNA多态位点分析进行。

4.鉴定细胞来源：在进行移植时，通常需要跟踪移植细胞在

受体内的状态，可以采用DNA多态位点分析确定细胞来源。遗传病致病基因的克隆微卫星遗传标记(shorttandemrepeat，STR)

指重复单位在2-6bp、并且呈串联排列的重复序列，其重复次数在群体中存在变异。如（CTA）n不同等位基因表现为n的差异。遗传病致病基因的克隆DNA多态性RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段长度多态）EcoRI内切酶切割GAATTC序列遗传病致病基因的克隆SNP（singlenucleotidepolymorphism）单核苷酸多态

一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异，SNP在基因组中分布相当广泛，人类基因组中每300个碱基对就出现一次。遗传病致病基因的克隆

拷贝数变异(copynumbervariation,CNV)

拷贝数变异(copynumbervariation,CNV),它是一种大小介于1kb到3Mb之间的DNA片段的缺失、重复、倒位和易位,在人的基因组中都分布广泛.遗传病致病基因的克隆DNA多态性的检测RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段长度多态）的检测遗传病致病基因的克隆微卫星遗传标记的检测

要检测个体的基因型，通常是采用PCR扩增结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法，即在重复序列两侧按单一序列设计引物，经过PCR扩增后，扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结果如图所示，根据电泳结果按片段大小依次命名等位基因1，2，3…遗传病致病基因的克隆基因拷贝数变异的检测方法

比较基因组杂交芯片（用于全基因组CNVs检测）原理：将目的基因和参考基因用不同的荧光进行标记后与芯片上的DNA片段进行杂交而产生不同的荧光信号比值，从而得到两者之间拷贝数的差别SNP芯片法（用于全基因组CNVs检测）原理：与比较基因组杂交芯片不同的是，SNP芯片不需要进行双杂交，只需将目的基因与SNP芯片杂交得到杂交信号强度，然后与已知的参考杂交信号对比得出目的基因与参考基因之间拷贝数的差别。实时荧光定量PCR（针对单个基因）原理：分别针对待检测基因上的序列和对照基因序列设计两对引物和标记不同荧光基团的检测探针。通过对扩增后两个探针信号指示的Ct值进行比较从而判断目标基因拷贝数。遗传病致病基因的克隆单基因病的传递方式

（一）常染色体显性遗传病（autosomaldominantdisease，AD）定义：致病基因位于常染色体上，致病基因为显性基因。遗传病致病基因的克隆常染色体隐性遗传病（autosomalrecessivediseases，AR）定义：致病基因位于常染色体上，致病基因为隐性基因。基因型与表现型的对应关系：基因型：AAAaaa表现型：正常正常（携带者）患者遗传病致病基因的克隆X连锁隐性遗传病（X-linkedrecessivediseases，XR）致病基因位于X染色体上，致病基因为隐性基因。遗传病致病基因的克隆X连锁显性遗传病（X-linkeddominantdiseases，XD）致病基因位于X染色体上，致病基因为显性基因。遗传病致病基因的克隆Y连锁遗传病（Y-linkeddiseases，YL）致病基因位于Y染色体上，随Y染色体遗传。遗传病致病基因的克隆线粒体遗传病（mitochondrialdiseases）致病基因位于线粒体基因组上，由于受精卵的细胞质主要来自卵子，存在于细胞质中的线粒体也来自卵子，所以线粒体遗传病表现为母系遗传遗传病致病基因的克隆克隆单基因遗传病－定位克隆的原理

定位克隆的基本思路是通过连锁分析原理进行基因定位。若多态性遗传标记与待定基因距离较远，则它们在向子代传递时会发生自由分离而呈现“连锁平衡”；反之，则不发生自由分离，而呈“共分离（Co-segregation）”现象。由此可以在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的致病基因。

使用的遗传标记：微卫星遗传标记，精细定位时也辅助用到SNP遗传标记遗传病致病基因的克隆

连锁分析法（linkageanalysis）

用连锁分析方法进行基因定位是通过分析拟定位致病基因产生的表型效应（如疾病）与染色体上多态位点之间的连锁关系。基本原理是位于同一染色体上两个基因位点（如致病基因与微卫星标记）

在减数分裂的过程中会发生交换与重组，假如两个位点相距很近的时候，遗传标记和致病基因（疾病表型）共分离，那么说明致病基因就在遗传标记附近，反之则致病基因不在遗传标记附近。遗传病致病基因的克隆Lod值

精确分析基因之间的连锁关系，通常采用优势对数法，也称Lod计分法。Lod得分是在一定重组率下两个位点相连锁的似然性与两个位点不连锁的似然性比值的对数值在进行连锁分析时，要计算

=0.0（不重组）到

=0.5（随机分配）的一系列Lod得分。当Lod得分为+3或更大时，肯定连锁；当Lod得分小于或等于-2时，排除连锁。Lod得分最大时的

值被接受为最大似然估计值。遗传病致病基因的克隆单基因遗传病致病基因的定位与克隆的流程遗传病致病基因的克隆遗传病致病基因的克隆

单基因遗传病致病基因克隆的研究策略定位（全基因组连锁分析）筛选候选基因基因突变的筛查验证（家系成员，正常对照群体的突变筛查）基因的功能研究，阐明致病机理遗传病致病基因的克隆单基因遗传病致病基因定位的实验方法

基于遗传病家系的全基因组扫描，对覆盖整个基因组的微卫星遗传标记，逐个验证其与疾病表型的连锁关系，找到与疾病表型相连锁的微卫星遗传标记，而将致病基因定位在两个或多个微卫星遗传标记所在的区域。微卫星遗传标记ABI3100遗传分析仪遗传病致病基因的克隆微卫星遗传标记

不同荧光标记引物扩增覆盖全基因组的382个微卫星标记遗传病致病基因的克隆ABI3100遗传分析仪遗传病致病基因的克隆遗传病致病基因的克隆新的房颤致病基因NUP155的发现及其致病机理研究

遗传病致病基因的克隆房颤（AF,AtrialFibrillation）是最常见的心律失常疾病之一，15%的中风是由房颤引起的。房颤病人正常人房颤遗传病致病基因的克隆遗传病致病基因的克隆来自南美洲的房颤病家系乌拉圭遗传病致病基因的克隆近亲结婚的隐性遗传的房颤家系遗传病致病基因的克隆NUP155基因测序结果遗传病致病基因的克隆遗传病致病基因的克隆NUP155蛋白

NUP155基因编码一种分子量为155kDa的核孔蛋白，NUP155蛋白是核孔复合体的重要成分。遗传病致病基因的克隆构建GFP的融合表达载体表达GFP和NUP155融合蛋白突变对NUP155蛋白定位的影响GFP:绿色荧光蛋白在特定波长的激光照射下可以发出绿色荧光遗传病致病基因的克隆GFP的发现－2008年诺贝尔化学奖遗传病致病基因的克隆突变对NUP155蛋白定位的影响遗传病致病基因的克隆NUP155Knockout小鼠模型基因诱捕（genetrap）

β-geoβ-gal+NeoTheBayGenomics/UniversityofCalifornia,Davis遗传病致病基因的克隆NUP155基因在小鼠心脏组织中的表达纯合子NUP155基因敲除小鼠死于胚胎发育的8.5天前，杂合子NUP155基因敲除小鼠能存活。RT-PCRWesternBlot遗传病致病基因的克隆NUP155基因在心肌细胞中的表达

免疫染色遗传病致病基因的克隆小鼠心电图的记录DSIFA-20电极的植入遗传病致病基因的克隆小鼠心电图的记录遗传病致病基因的克隆遗传病致病基因的克隆NUP155基因导致房颤的机理NUP155基因突变房颤

机理？NUP155功能：核孔复合体的成分,与NUP155相互作用的蛋白Gle1B负责mRNA的运输房颤发生的机理：心脏电活动改变（离子通道基因），心脏结构的改变遗传病致病基因的克隆NUP155基因敲除小鼠心脏组织结构a-actin免疫染色遗传病致病基因的克隆心房心肌细胞动作电位全细胞膜片钳技术记录心肌细胞动作电位遗传病致病基因的克隆基因敲除小鼠心房组织的电镜照片遗传病致病基因的克隆基因敲除小鼠心房组织的电镜照片NPCNPCNPC遗传病致病基因的克隆Nup155与HSP70的关系Gle1蛋白与NUP155蛋白相互作用将Gle1蛋白定位到核孔复合体上2.Gle1蛋白与核孔蛋白CG1相互作用,介导HSP70mRNA的转运3.小鼠敲除HSP70基因影响小鼠心脏的收缩功能和心肌细胞钙离子的动态平衡遗传病致病基因的克隆NUP155对HSP70mRNA转运的影响RT-PCR免疫染色NUP155基因敲除小鼠心肌细胞遗传病致病基因的克隆房颤致病基因的致病机理分子机制突变对蛋白定位的影响突变对蛋白功能的影响（HSP70mRNA转运）动物模型（基因敲除小鼠）表型，心脏组织结构，细胞水平（动作电位），HSP70mRNA转运。遗传病致病基因的克隆总结：房颤致病基因的克隆连锁分析定位致病基因定位区域内候选基因的突变筛选，发现致病基因正常对照人群中突变位点的验证分子，细胞，动物模型等各个层次阐明致病的机制遗传病致病基因的克隆MEF2A基因突变与冠心病遗传病致病基因的克隆冠心病家系

冠心病是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称。是指供给心脏营养物质的血管——冠状动脉发生严重粥样硬化或痉挛，使冠状动脉狭窄或阻塞，以及血栓形成造成管腔闭塞，导致心肌缺血缺氧或梗塞的一种心脏病，亦称缺血性心脏病。遗传病致病基因的克隆连锁分析定位致病基因遗传病致病基因的克隆定位区域内的候选基因突变筛选定位区域内含93个基因，其中43个已知基因，50个假想基因MEF2A转录因子，肌肉细胞增强因子-2家族成员（MEF2family），mef2a基因在小鼠胚胎发育的早期的血管中就有表达遗传病致病基因的克隆MEF2A基因突变筛选遗传病致病基因的克隆MEF2A蛋白在细胞中的定位HVSMC(humanumbilicalvascularendothelialcells)人脐静脉内皮细胞

HUVEC(Humanvascularsmoothmusclecells)人血管平滑肌细胞免疫染色遗传病致病基因的克隆MEF2A基因突变对定位的影响遗传病致病基因的克隆MEF2A基因突变对转录的影响ANFpromoterMEF2A,GATA-1LuciferaseAssaySystem萤光素酶检测系统遗传病致病基因的克隆荧光素酶报告基因检测荧光素酶可以催化荧光素生物荧光，通过荧光测定仪或液闪测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。

通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方，构建成报告基因质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。遗传病致病基因的克隆

总结

通过定位克隆的方法，首次发现冠心病的致病基因Mef2a，21bp的突变影响了MEF2A蛋白的入核，从来影响了下游靶基因的表达。遗传病致病基因的克隆多基因疾病的研究策略

全基因组关联分析是目前研究多基因疾病的常用方法全基因组关联分析(genomewideassociationstudy，GWAS)是应用人类基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)为标记进行病例-对照关联分析，以期发现影响复杂性疾病发生的遗传特征的一种新策略遗传病致病基因的克隆全基因关联分析的基本思路对全基因组范围内的常见遗传变异:单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)进行总体关联分析的方法。

即在全基因组范围内选择遗传变异进行基因分型,比较病例和对照间每个变异频率的异差,计算变异与疾病的关联强度,选出最相关的变异进行验证并最终确认与疾病相关。

理论依据：如果人群基因组中一些SNP与某种疾病相关联，理论上这些疾病相关SNP等位基因频率在某种疾病患者中应该高于未患病对照人群遗传病致病基因的克隆多基因遗传病遗传病致病基因的克隆遗传病致病基因的克隆遗传病致病基因的克隆

2005年，Science杂志首次报道了视网膜黄斑变性GWAS结果，在医学界和遗传学界引起了极大的轰动，此后一系列GWAS陆续展开。